【摘要】：飲酒后傷害案件屢見不鮮,其中,飲酒后遭受輕度外力打擊發(fā)生致死性蛛網(wǎng)膜下腔出血(traumatic subarachnoid hemorrhage,t SAH)的案例時有發(fā)生。如何界定飲酒在此類案件中的參與度,已成為法醫(yī)鑒定工作迫切解決的難題。深入系統(tǒng)地研究飲酒對腦血管的損傷機制,將有助于對此類案件的科學(xué)鑒定。乙醇(ethanol,Et OH)又名酒精,是各種酒類飲品中主要的有效成分。對乙醇損傷機制的研究涉及各個方面,包括神經(jīng)損傷、凝血障礙、血流及血管舒縮功能改變,但這些改變尚不足以解釋飲酒后發(fā)生t SAH的原因。另外,乙醇在體內(nèi)經(jīng)過乙醇脫氫酶作用產(chǎn)生的一級代謝產(chǎn)物乙醛(acetaldehyde,ACA)也可能成為心腦血管系統(tǒng)損傷的潛在殺手。近年來,越來越多的研究證實,乙醛不僅是飲酒后誘發(fā)各類癌癥的罪魁禍?zhǔn)?也是造成酒精性心臟病、酒精性肝病的主要毒性物質(zhì)。生理情況下,腦血管自身具有自主調(diào)節(jié)功能,腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞在感受外界刺激后通過細(xì)胞間對話以維持正常的血管舒張與收縮功能,調(diào)節(jié)腦灌注,確保腦功能需求。但是,在急性及慢性乙醇累毒后,是否可通過改變腦血管內(nèi)環(huán)境及損壞血管壁細(xì)胞導(dǎo)致腦血管功能與結(jié)構(gòu)改變,其機制尚不十分明確。血管壁細(xì)胞不僅擁有乙醇脫氫酶等參與乙醇代謝,還含有NOX(NADPH oxidase)及NOS(nitric oxide synthase)等多種氧化酶,參與ROS/RNS生成與轉(zhuǎn)化,同時也是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)的作用靶器官。盡管已有文獻(xiàn)報道,乙醇可通過ROS、RNS、RAS等多途徑參與調(diào)節(jié)心腦血管疾病,但是,關(guān)于飲酒后乙醇及代謝產(chǎn)物乙醛通過何種途徑導(dǎo)致腦血管損傷,有待進(jìn)一步探討。本課題擬從飲酒后腦血管功能及結(jié)構(gòu)異常為切入點,從以下三個方面研究乙醇的血管毒性作用及機制:(1)建立慢性飲酒大鼠模型,觀察其腦血管功能及結(jié)構(gòu)變化;(2)觀察乙醇及代謝產(chǎn)物乙醛對血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的毒性作用;(3)探討氧化應(yīng)激機制在乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛對血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞毒性中的作用。通過上述研究,探討飲酒后輕度外力打擊導(dǎo)致t SAH死亡的機制,為此類案件法醫(yī)鑒定提供新的理論依據(jù)。第一部分飲酒對大鼠腦動脈功能及結(jié)構(gòu)的影響目的: 過量飲酒可導(dǎo)致腦血管灌注壓增加、腦血管擴張和血管通透性增加,使腦血管自穩(wěn)態(tài)平衡破壞,并損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本部分研究擬通過制備慢性飲酒動物模型,觀察腦基底動脈環(huán)舒縮功能及腦血管結(jié)構(gòu)的變化,從動物整體水平明確飲酒對腦動脈功能與結(jié)構(gòu)的影響,闡明飲酒的血管損傷靶點。方法: 1采用劑量遞增自由飲酒模式(20%v/v酒-水溶液)持續(xù)飲酒12月,建立長期飲酒大鼠模型,并記錄大鼠一般情況及體重的變化;2采用HE染色、Masson三色染色法和硫堇染色分別觀察慢性飲酒大鼠腦血管和神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;3采用微血管張力儀檢測長期飲酒大鼠腦基底動脈環(huán)乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性和硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的變化,以及血管緊張素(AngⅡ)、內(nèi)皮素(ET-1)誘導(dǎo)收縮反應(yīng)的變化,明確飲酒對血管舒縮功能的影響及其損傷靶點;4采用放射性免疫分析方法,檢測長期飲酒大鼠血液中內(nèi)皮素和血管緊張素水平的變化;5采用DHE染色法檢測腦血管環(huán)活性氧,并采用免疫熒光染色及Western blot方法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白在腦血管環(huán)中的表達(dá)變化,以探討氧化應(yīng)激在飲酒造成腦動脈功能與結(jié)構(gòu)改變中的作用。結(jié)果: 1慢性飲酒大鼠體重顯著降低,倦怠少動,反應(yīng)遲鈍,毛發(fā)干澀;2慢性飲酒大鼠腦內(nèi)小動脈及基底動脈血管管壁增粗,管腔變窄,壁/腔比明顯增大,膠原成分增多,并可見海馬神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死。3慢性飲酒大鼠腦基底動脈對ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)下降,SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)無明顯變化;0.1μM AngⅡ誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)性增強,而ET-1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)無明顯變化。4慢性飲酒大鼠血漿中腎素活性(PRA)和血管緊張素Ⅱ水平升高,內(nèi)皮素-1含量無明顯變化。5慢性飲酒大鼠腦基底動脈環(huán)ROS及NOX亞基p47 phox蛋白表達(dá)升高。小結(jié): 本部分實驗成功建立了慢性飲酒大鼠模型,并證實了長期大量飲酒可導(dǎo)致大鼠腦動脈重構(gòu),腦血管功能紊亂,并以內(nèi)皮依賴性舒張功能下降為著。長期飲酒后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活,ROS水平表達(dá)升高,提示持久的氧化應(yīng)激造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是長期飲酒導(dǎo)致腦血管穩(wěn)態(tài)失衡的重要因素之一。第二部分乙醇和乙醛對血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用及機制目的： 乙醇可經(jīng)肝臟乙醇脫氫酶(ADH)代謝為乙醛,并經(jīng)乙醛脫氫酶(ALDH)代謝為乙酸。當(dāng)超過機體代謝能力時,乙醇、乙醛在體內(nèi)蓄積,對心腦血管等器官造成損傷。本部分研究擬采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),從細(xì)胞水平觀察乙醇和乙醛對血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用及細(xì)胞死亡機制,并探討氧化應(yīng)激在其致?lián)p傷過程中的作用。方法： 1給予HUVEC細(xì)胞不同濃度、不同時間的乙醇和乙醛刺激,采用MTT檢測HUVEC細(xì)胞生存率,觀察乙醇、乙醛對HUVEC的細(xì)胞毒作用;2采用流式細(xì)胞術(shù)檢測乙醇和乙醛處理后HUVCE細(xì)胞凋亡情況,明確乙醇、乙醛誘導(dǎo)HUVCE細(xì)胞死亡的方式;3采用透射電鏡觀察乙醇和乙醛處理對HUVCE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響;4采用共聚焦顯微鏡和Western blot方法觀察乙醇和乙醛對HUVEC細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)表達(dá)的影響,明確乙醇和乙醛誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞死亡的自噬機制;5采用Western blot方法檢測乙醛對HUVEC細(xì)胞PI3K-AKT-m TOR和RAS-MEK-ERK通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,并使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞,以闡明乙醛誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞發(fā)生自噬的信號機制;6采用特異ROS探針標(biāo)記和熒光顯微鏡觀察乙醇和乙醛處理后氧化應(yīng)激產(chǎn)物的變化;并采用外源性過氧化氫(H2O2)和非特異性內(nèi)源性ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)預(yù)處理細(xì)胞,以明確乙醛是否可通過激活ROS-ERK通路誘導(dǎo)HUVCE細(xì)胞發(fā)生自噬。結(jié)果：1乙醇和乙醛均使HUVEC細(xì)胞生存率呈時間、劑量依賴性下降,并且乙醛的毒性作用比乙醇更快、更強;2流式細(xì)胞術(shù)及透射電鏡結(jié)果顯示,乙醇(200m M)處理HUVEC細(xì)胞24h和48h,可見細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,這些凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則,核染色質(zhì)電子密度增高、邊集呈半月狀。乙醛(20μM)處理HUVEC細(xì)胞6h,細(xì)胞即發(fā)生非凋亡性細(xì)胞死亡。HUVEC細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體;3乙醛處理HUVEC細(xì)胞后,細(xì)胞骨架排列紊亂,胞體縮小,自噬標(biāo)記性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈現(xiàn)時間及劑量依賴性升高,而給予不同劑量的乙醇處理HUVEC細(xì)胞不同時間后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無明顯變化;4乙醛處理HUVEC細(xì)胞后,磷酸化ERK呈現(xiàn)時間依賴性表達(dá)升高,而p AKT/AKT、pm TOR/m TOR表達(dá)均無明顯變化,給予ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后,可部分翻轉(zhuǎn)乙醛誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高;5乙醇和乙醛處理誘導(dǎo)的ROS增高呈現(xiàn)一過性,乙醇處理30min后ROS達(dá)頂峰,隨后逐漸下降;乙醛誘導(dǎo)的ROS增高出現(xiàn)更早、幅度更高、持續(xù)時間更長,20min時ROS達(dá)峰值,50min后仍高于對照組;6給予外源性H2O2處理HUVEC細(xì)胞,可使磷酸化ERK表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加,給予非特異性內(nèi)源性ROS清除劑NAC則可部分逆轉(zhuǎn)乙醛誘導(dǎo)的磷酸化ERK水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。小結(jié)：過量、持久的乙醇刺激可誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞發(fā)生凋亡;而乙醛則可以通過誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS,從而激活RAS-MEK-ERK通路快速誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞發(fā)生自噬,參與細(xì)胞損傷過程,而經(jīng)典的PI3KAKT-m TOR通路在此過程中無明顯作用。第三部分過量乙醇對人腦血管平滑肌細(xì)胞的毒性作用機制目的： 血管平滑肌細(xì)胞作為血管壁的主要細(xì)胞成分之一,在決定血管活性和血管結(jié)構(gòu)中具有重要意義。本部分研究采用人腦血管平滑肌細(xì)胞(human brain vascular smooth cell,HBVSMC),從細(xì)胞水平觀察乙醇對腦血管平滑肌細(xì)胞的毒性作用及其對細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。方法： 1給予不同濃度的乙醇處理HBVSMC細(xì)胞,采用MTT法檢測HBVSMC細(xì)胞生存率,以觀察乙醇對HBVSMC的細(xì)胞毒作用;2利用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測乙醇處理后HBVSMC細(xì)胞凋亡情況,明確乙醇誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞死亡的方式;3觀察乙醇處理后HBVSMC細(xì)胞的形態(tài)變化,并用鬼筆環(huán)肽特異性標(biāo)記F-actin,Dnase標(biāo)記G-actin,通過共聚焦顯微鏡觀察不同時間、不同劑量乙醇對HBVSMC細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響;4提取細(xì)胞總蛋白,并分步提取HBVSMC細(xì)胞F-actin和G-actin蛋白,Weston blot方法觀察HBVSMC細(xì)胞F-actin/G-actin比值、細(xì)胞收縮表型相關(guān)蛋白SM22α、絲切蛋白Cofilin及細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的變化,進(jìn)一步明確乙醇對HBVSMC細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響;5采用特異ROS探針標(biāo)記和熒光顯微鏡觀察乙醇處理后HBVSMC細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物的變化。結(jié)果： 1使用不同劑量的乙醇(0-800m M)處理HBVSMC細(xì)胞24h,對HBVSMC細(xì)胞生存率的影響不明顯,給予高于200m M乙醇持續(xù)刺激48h對HBVSMC細(xì)胞生存率有明顯的抑制作用,呈現(xiàn)時間、劑量依賴性;2過量乙醇刺激可誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞發(fā)生凋亡;3過量、持久的乙醇刺激后,HBVSMC細(xì)胞瘦長,細(xì)胞間縫隙增大,微絲排列分布及F-actin/G-actin比值無明顯變化。乙醇對細(xì)胞收縮表型相關(guān)蛋白SM22α的表達(dá)無明顯影響,但可以使絲切蛋白Cofilin表達(dá)升高,細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)下降;4乙醇處理可誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞一過性ROS的產(chǎn)生。小結(jié):過量、持久乙醇作用可誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞發(fā)生凋亡,并使Cx43和Cofilin表達(dá)異常,但是細(xì)胞骨架整體結(jié)構(gòu)未見明顯改變,且SM22α表達(dá)水平及F-actin/G-actin比值無明顯變化。另外,乙醇處理可能通過誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞一過性ROS的產(chǎn)生,繼而參與其凋亡過程。結(jié)論： 1長期大量飲酒可導(dǎo)致大鼠腦血管內(nèi)皮依賴性舒張功能下降,腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活,ROS水平升高。因此,持久的氧化應(yīng)激造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能是長期飲酒導(dǎo)致腦血管穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因之一。2過量、持久的乙醇刺激可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡;而乙醛則可以通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS,激活ERK快速誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬,參與細(xì)胞損傷過程。3過量乙醇誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞ROS生成及Cofilin和Cx43表達(dá)異常,促進(jìn)了平滑肌細(xì)胞的凋亡,加重了血管損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：D923.2

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本文編號：2506641