研究目的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是由免疫介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有髓鞘脫失、髓鞘再生障礙、軸索損傷和神經(jīng)變性等特點,以腦和脊髓內(nèi)白質(zhì)病理改變?yōu)橹?導致MS患者嚴重殘疾,其病理生理機制復雜,尚無特效治療策略。MS經(jīng)典動物模型是實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型。本研究采用雌性C57BL/6小鼠EAE模型,探究針刺“大椎”(GV14)、雙側“腎俞”(BL23)、雙側“足三里”(ST36)穴對雌性C57BL/6小鼠EAE模型的治療作用,并探討其療效機制:①腦組織JAK2、p-STAT3的表達變化。②血清中促炎細胞因子白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的表達變化。為深入認識MS的發(fā)病機制,并為臨床針刺治療MS提供新的思路及理論支持。研究方法將40只雌性C57BL/6小鼠稱重編號后,按隨機數(shù)字表分成空白對照組、EAE模型組、激素治療組、針刺治療組4個組,每組10只。除空白對照組外,其余各組采用髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55,MOG35-55)混合完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)制備的完全抗原聯(lián)合百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)將雌性C57BL/6小鼠誘導成EAE模型�？瞻讓φ战M和EAE模型組,免疫后第14天開始每天抓取、固定一次,并用0.1ml/10g/d生理鹽水灌胃,至免疫后第28天取材。針刺治療組免疫后第14天開始,每天同一時間(上午9:00)針對“大椎”、雙側“腎俞”、雙側“足三里”穴進行針刺治療,每次留針15分鐘,至免疫后第28天取材,共15次。激素治療組免疫后第14天開始,每天同一時間(上午9:00),對小鼠進行激素沖擊療法,每次醋酸潑尼松混懸液(0.6mg/ml,醋酸潑尼松片用生理鹽水配制成要求的濃度)灌胃,0.1ml/10g/d,連續(xù)治療15天。從免疫后第0天開始直到免疫后第28天實驗結束取材為止,每天在相同的時間點(下午14:00-16:00)觀察小鼠的行為學變化(如毛色、行為及飲食),隔天稱量記錄小鼠的體質(zhì)量,記錄神經(jīng)功能缺損評分。免疫后第28天進行眼球采血,取腦,進行腦組織勞克堅牢藍(Luxol fast blue,LFB)髓鞘染色觀察脫髓鞘程度,檢測腦組織中JAK2、p-STAT3免疫組化表達,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-17的含量。研究結果1.體質(zhì)量及神經(jīng)功能缺損評分于免疫后第10天,EAE模型組、激素治療組、針刺治療組三組小鼠均先后發(fā)病,逐漸出現(xiàn)精神萎靡,食欲下降,體重減輕,尾部無力、肢體癱瘓、二便失禁和偶有背部皮膚破潰等,逐漸加重。空白對照組無小鼠發(fā)病,體重持續(xù)增長,活動度正常。免疫后第0天,各組小鼠體質(zhì)量和神經(jīng)功能缺損評分無統(tǒng)計學差異(P0.05);免疫后第14天,與空白對照組相比,EAE模型組、激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均持續(xù)下降(P0.01),神經(jīng)功能缺損評分均顯著增加(P0.01);免疫后第20天,與EAE模型組相比,激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均較高(P0.01)、神經(jīng)功能缺損評分均較低(P0.01);與激素治療組相比,針刺治療組的小鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學差異(P0.05)、神經(jīng)功能缺損評分較高(P0.01);免疫后第28天,與EAE模型組相比,激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均較高(P0.01)、神經(jīng)功能缺損評分均較低(P0.01,P0.05);兩治療組相比,針刺治療組小鼠的體質(zhì)量較低,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),神經(jīng)功能缺損評分無顯著差異(P0.05)。2.腦組織LFB髓鞘染色空白對照組小鼠的腦組織LFB髓鞘染色無異常表現(xiàn),髓鞘致密,排列整齊。EAE模型組、激素治療組和針刺治療組小鼠的腦組織可見大小不等的片狀髓鞘脫失區(qū),呈空泡樣改變,以側腦室周圍最明顯。其中EAE模型組,髓鞘脫失最明顯,并且存在有大量空泡樣變化;激素治療組、針刺治療組較EAE模型組髓鞘脫失較少,空泡化程度改變較輕。3.腦組織免疫組化JAK2、p-STAT3腦組織JAK2、p-STAT3免疫組化陽性表達呈黃色。與空白對照組相比,EAE模型組、激素治療組和針刺治療組的小鼠腦組織JAK2、p-STAT3的表達水平有顯著差異(P0.01);與EAE模型組相比,激素治療組和針刺治療組的小鼠腦組織JAK2、p-STAT3的表達水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);針刺治療組、激素治療組相比,小鼠腦組織中JAK2、p-STAT3的表達水平無統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.血清IL-17與空白對照組相比,EAE模型組、激素治療組和針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達水平升高,有顯著差異(P0.01);與EAE模型組相比,激素治療組、針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01,P0.05);針刺治療組和激素治療組相比,針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達水平較高,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論1.針刺、激素均可顯著升高雌性C57BL/6小鼠EAE模型的體質(zhì)量,以及降低神經(jīng)功能缺損評分,提示針刺、激素均可改善雌性C57BL/6小鼠EAE模型的臨床癥狀,且兩者作用相當。2.EAE模型組、針刺治療組和激素治療組腦組織免疫組化JAK2、p-STAT3表達升高,提示JAK2-STAT3信號轉導通路影響EAE發(fā)病,針刺、激素可顯著下調(diào)雌性C57BL/6小鼠EAE模型腦組織免疫組化JAK2、p-STAT3表達,提示針刺、激素可調(diào)節(jié)JAK2-STAT3信號轉導通路改善EAE發(fā)病,且兩者作用相當。3.針刺,激素可顯著下調(diào)雌性C57BL/6小鼠EAE模型血清IL-17的含量,提示針刺,激素可減輕炎性反應程度,其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT3信號轉導通路,從而影響IL-17的分泌有關。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R245
【部分圖文】：

圖２：環(huán)境因素會影響免疫系統(tǒng)，從而影響ＭＳ發(fā)病和病情。通過影響免疫系統(tǒng)功能，導致神經(jīng)??炎癥攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最終導致ＭＳ。ＡＰＣ、抗原呈遞細胞；Ａｂ、抗體：Ｃ、補充；ＣＭＶ、巨細胞??病毒；ＥＢＶ、巴爾病毒；ＧＭ－ＣＳＦ，粒細胞單核細胞集落刺激因子；ｍｙｅｌｉｎ－Ａｇ、髓鞘抗原；ＮＯ，一??氧化氮；ＲＯＳ，活性氧；Ｔｃ、細胞毒細胞；ＴＧＦ－Ｐ、轉化生長因子－ｐ；?ＴＨ、輔助Ｔ細胞；ＴＮＦ、腫瘤??壞死因子；Ｔｓ、Ｔ?抑制細胞。［７４］?Ｏｌｓｓｏｎ?Ｔ，Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ?Ｌ?Ｆ，?Ａｌｆｒｅｄｓｓｏｎ?Ｌ．?Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｇｅｎｅｔｉｃ，??ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ?ａｎｄ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ?ｒｉｓｋ?ｆａｃｔｏｒｓ?ｆｏｒ?ｍｕｌｔｉｐｌｅ?ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．?Ｎａｔｕｒｅ?Ｒｅｖｉｅｗｓ?Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，?２０１７，?１３（１）：２５．??３．３．２適應性免疫??目前，ＭＳ發(fā)病機制，主要認為其與自身反應性初始性ＣＤ４＋Ｔ淋巴細胞的激活有??關，是ＭＳ發(fā)病機理中的初始反應和關鍵。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，初始性ＣＤ４＋Ｔ細胞識??別表達ＨＬＡ?ＩＩ型分子的小膠質(zhì)細胞、浸入的巨噬細胞和Ｂ細胞遞呈的抗原�；罨淖�??身反應性Ｔ淋巴細胞的細胞表面表達的粘附分子，使其能夠結合內(nèi)皮－腦屏障（ＥＢＢ），??同時，活化的Ｔ淋巴細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（ＭＭＰ），其允許在ＥＢＢ中產(chǎn)生開口，從??Ｔ，

子介導的ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信號轉導通路的激活，以此預防此信號轉導通路激活過度引起其細??胞增殖、分化、代謝異常和生理功能紊亂，形成負反饋調(diào)節(jié)。ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信號通路，如??圖１、圖２［１Ｑ】。??八?Ｃｙｔｏｋｉｎ？??ｙ?／?Ｃｙｔｏｋｉｒ＞ｅ??Ｒｅｃｅｐｔｏｒ??１?ｆｔ???異—??＾?＾?ｋ?Ｇｅｎｅ??ｃ／）?＾?ｊ?＾?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??３２??

Ｋ－ＳＴＡＴ信號傳導調(diào)節(jié)ＣＤ４＋Ｔ細胞的分化。ＣＤ４＋Ｔ細胞根據(jù)它們遇到的細同。具體而言，ＩＬ－１２通過激活ＪＡＫ２／ＴＹＫ２和ＳＴＡＴ４誘導Ｔｈｌ細胞分化，ＴＡＴ６誘導Ｔｈ２細胞分化，而丨Ｌ－６和丨Ｌ－２３以及ＩＬ－ｌ?Ｐ通過激活ＪＡＫ１／２和Ｓ化。［１０］?Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ?Ｅ?Ｎ，Ｌｉｕ?Ｙ，?Ｍｃｆａｒｌａｉｉｄ?Ｂ?Ｃ，?ｅｔ?ａｌ．?Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｊａｎｕｓ?Ｋｉｎｄ?Ａｃｔｉｖａｔｏｒ?ｏｆ?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?Ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?Ｍｕｌｔｉｐｌｅ?Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ?ａｎｄ?ｔｈｅ?Ａｎｉｍａｌ?Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ?Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］，?Ｊｏｕｒｎａｌ?ｏｆ?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?＆?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ?ｔ?Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ?Ｓｏｃｉｅｔｙ?ｆｏｒ?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?＆?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ，?２０１４，?３４（８）：５７７－５８８．??Ｔ在ＭＳ及ＥＡＥ的作用???ＳＴＡＴ??－ＳＴＡＴ信號轉導通路中，ＪＡＫ和ＳＴＡＴ蛋白是在ＥＡＥ動物模型中。ＳＴＡＴ蛋白敲除小鼠己被用于研究不同ＳＴＡＴ蛋白在ＥＡＥ動物模ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信號通路作為炎癥和自身免疫疾病的理想治療靶點備受
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本文編號：2873568