【摘要】：清心解瘀方是在冠心病“瘀毒”創(chuàng)新病因理論指導下,由陳可冀院士經(jīng)驗方愈梗通瘀湯精簡化裁而來�！笆濉眹铱萍贾斡媱濋_展的一項清心解瘀方對穩(wěn)定性冠心病患者臨床終點事件影響的多中心、大樣本、隨機、雙盲、安慰劑對照研究結果表明,在冠心病二級預防的基礎上加用清心解瘀方,可以降低穩(wěn)定性冠心病患者心源性死亡、非致死性心肌梗死及卒中的發(fā)生,并可減少復合終點事件的發(fā)生率,且安全性良好。同時,前期研究發(fā)現(xiàn)清心解瘀方可以降低炎癥反應增強的冠心病患者超敏C反應蛋白(hs-CRP)等炎癥因子水平。為進一步探討清心解瘀方發(fā)揮藥效的作用機制,本研究在課題組前期工作基礎上進行了相關實驗研究。研究一清心解瘀方干預穩(wěn)定性冠心病患者血清代謝組學研究目的:為深入探討清心解瘀方對機體代謝途徑及代謝物產生的影響,本研究在課題組前期工作基礎上進行了血清代謝組學研究。方法:課題組前期進行了多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照試驗,在常規(guī)冠心病二級預防措施基礎上,試驗組加用清心解瘀方顆粒劑治療,對照組采用安慰劑作為對照,共治療6個月,評價清心解瘀方干預穩(wěn)定性冠心病患者的臨床終點療效和安全性。本實驗從其中抽取共93例患者的血樣,其中試驗組51例,對照組42例。采用UPLC/MS SYNAPT G2-Si進行血清代謝組學研究。將質譜分析所得的原始數(shù)據(jù)導入配套的Progenesis QI(Waters,Milford,USA)工作站中,將產生的多元數(shù)據(jù)矩陣導入EZinfo數(shù)據(jù)處理軟件中進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA),選出max fold change2,Abundance1000,P value0.05的化合物,對篩選出的化合物進行匹配鑒定,含量分析和代謝通路分析。結果:PLS-DA分析發(fā)現(xiàn),試驗組和對照組在治療6個月后代謝物具有明顯差異,能夠進行較好的分離。但PCA分析可能因為臨床樣本的個體差異而無法對差異進行靈敏的分析�；赑LS-DA分析,經(jīng)過篩選共有17種差異代謝物。與對照組相比,試驗組共有10種差異代謝物上調,7種代謝物下調。進一步對這些差異代謝物的代謝通路分析發(fā)現(xiàn),清心解瘀方干預后變化最大的代謝通路為甘油磷脂代謝通路。結論:清心解瘀方對穩(wěn)定性冠心病患者影響最大的代謝通路是甘油磷脂代謝通路。研究二清心解瘀方干預ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型脂質代謝及機制研究目的:根據(jù)第一部分對清心解瘀方干預6個月后穩(wěn)定性冠心病患者血清代謝組學研究結果,清心解瘀方影響的代謝物主要來自甘油磷脂代謝通路,我們采用清心解瘀方干預高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化(AS)模型,觀察清心解瘀方對ApoE-/-小鼠AS、脂質代謝、短鏈脂肪酸代謝及血清炎癥因子等的影響。方法:40只雄性ApoE-/-小鼠隨機分為4組,每組10只。分別為清心解瘀方低劑量組(Low)、清心解瘀方高劑量組(High)、模型組(Mod)和健康對照組(Chow)。對照組給予無膽固醇低脂飼料[脂肪含量10%(wt/wt),膽固醇含量0%],其余三組給予高脂肪高膽固醇飼料喂養(yǎng),同時灌胃給予相應藥物12周后采集小鼠代謝物、血清、回腸、回盲瓣內容物、肝臟和主動脈。評價各組小鼠主動脈斑塊面積、單核/巨噬細胞浸潤情況、肝臟組織細胞形態(tài)、檢測小鼠尿液短鏈脂肪酸代謝、血清脂質組學、血脂水平、血清白介素-1β(IL-1β)水平、脂代謝相關基因mRNA表達水平、膽固醇逆轉運基因mRNA表達水平。結果:清心解瘀方可劑量依賴性地降低ApoE-/-小鼠AS斑塊面積和單核/巨噬細胞在斑塊部位的水平、肝臟脂肪變性,降低血清低密度脂蛋白(LDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,并明顯升高高密度脂蛋白(HDL-C)水平,同時可降低血清IL-1β水平。通過對血清脂質代謝進行檢測發(fā)現(xiàn),清心解瘀方干預后影響最大的代謝通路是甘油磷脂代謝通路,與第一部分臨床樣本的結果相符。同時,我們發(fā)現(xiàn)了22種差異代謝物。Low組、High組可顯著改變甘油磷脂代謝通路中關鍵酶溶血磷脂酸脂�；D移酶(AGPAT)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)、膽堿/乙醇胺磷酸轉移酶(CEPT)和卵磷脂-膽固醇�；D移酶(LCAT)以及肝臟膽固醇代謝和膽固醇逆轉運基因清道夫受體B1(SR-BI)、ATP結合盒蛋白A1(ABCA1)、ATP結合盒蛋白G1(ABCG1)、載脂蛋白A1(APOA-1)的mRNA表達水平,與Chow組和Mod組均具有顯著差異。清心解瘀方可顯著升高小鼠尿液丁酸、異戊酸(ISO-VA)、4-甲基戊酸(4-MEVA)水平。結論:清心解瘀方具有抗AS作用,可改善小鼠脂質代謝、短鏈脂肪酸代謝及血清IL-11β水平。清心解瘀方對ApoE-/-小鼠甘油磷脂代謝通路影響最大,其機制可能與改變通路中關鍵酶的mRNA表達水平有關。研究三清心解瘀方重塑高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠AS模型腸道菌群目的:在證實清心解瘀方具有抗AS作用基礎上,通過16S rRNA測序初步研究其與腸道菌群的關系,以及抗AS作用與腸道菌群結構變化的相關性。方法:小鼠分組同研究二,采集回盲瓣內容物進行16S rRNA測序。對腸道菌群樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進行alpha多樣性、beta多樣性和差異物種分析和相關性分析。結果:清心解瘀方可影響高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠AS模型腸道菌群物種豐富度但未影響物種多樣性。在所有16S rRNA測序樣本中,經(jīng)過拼接和過濾得到449個不同的操作分類單元(OTUs)。45%的OTUs(202個)為各組共有,而僅有12%的OTUs(55個)為各組特有。這些OTUs經(jīng)過匹配鑒定,共映射到130個菌屬,在各組間大部分菌屬(71個)是共有的,僅有19個菌屬為特有菌屬。四組小鼠腸道菌群構成絕大部分為以下5種腸道菌門:厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和撫微菌門(Verrucomicrobia)。四組小鼠腸道菌群豐度差異前 15位的菌屬為Lactobacillus、Lachnospiraceae、Faecalibaculum Lachnospiraceae、Lachnoclostridium、Bifidobacterium、Blautia、Erysipelatoclostridium、A kkermansia、Clostridium、Ruminococcus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Enterorhabdus、Helicobacter、g_unclassified p Firmicutes。清心解瘀方可顯著升高Akkermansia(屬疣微菌門)的比重,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。腸道菌群差異物種與血清HDL-C呈正相關,同時與TC、TG、LDL-C呈負相關的菌屬只有Akkermansia菌。3個菌屬(Helicobacter,Blautia和Desulfovibrio)同IL-1β均呈現(xiàn)負相關,2個菌屬(Bifidobacterium,Ruminococcus_torques_groups)呈正相關。有7個菌屬與3種短鏈脂肪酸水平呈正相關且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);有5個菌屬與3種短鏈脂肪酸呈負相關且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。小鼠腸道菌群網(wǎng)絡群落相互作用分析發(fā)現(xiàn),Lachnoclostridium屬、Erysipelatoclostridium屬、Clostridium屬和Blautia屬兩兩呈正相關,提示可能存在共生關系(Community 1)。Bifidobacterium 屬、Lactobacillu 屬和Faecalibaculum屬三者兩兩呈正相關,提示可能存在共生關系(Community 2)。而兩個可能存在共生關系的系統(tǒng)間兩兩呈現(xiàn)負相關,提示可能存在拮抗關系。Akkermansia屬與Erysipelatoclostridium屬呈正相關,而與Faecalibaculum屬和Lactobacillus屬均呈負相關。因此我們推測,清心解瘀方可能通過增加Akkermansia屬和產SCFAs菌(Lachnospiraceae,Blautia,Clostridium)的豐度產生抗AS作用。結論:清心解瘀方可重塑腸道菌群結構,并且菌群結構變化與血清脂質水平和抗AS作用具有相關性。
【圖文】：

圖１腸道菌群代謝物與ＣＶＤ關系示意圖逡逑注：ＭＭＩ：ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ－ｉｍｍｕｎｉｔｙ逡逑研究表明腸道菌群及其代謝物在ＡＳ及ＣＶＤ的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用（圖１邋）。逡逑腸道菌群作為一個具有活力和雙向調節(jié)的免疫及代謝調控“器官”，發(fā)揮了代謝和免疫調逡逑控作用。因此，腸道微生物途徑及腸道微生物相關的ＣＶＤ代謝物可能極大地促進心血逡逑管健康尤其是預防ＣＶＤ。顯然，明確微生物及其代謝物與ＣＶＤ的因果關系是腸道菌群逡逑及生物標志物研究中一個非常重要的方面。存在于人體腸道內的腸道菌群代謝物作為逡逑“代謝過濾器”，顯著影響宿主對飲食消化吸收的方式。飲食是影響腸道微生物多樣性最逡逑重要的因素［１（）７］。內源性代謝導致的慢性低度炎癥可顯著影響膽固醇代謝平衡、胰島素逡逑抵抗和血管炎癥。由于腸道微生物作在ＣＶＤ疾病中起到的作用，把其作為藥物治療的逡逑靶點之一對ＣＶＤ的防治具有重要意義。在相關的疾病模型中把微生物代謝物（代謝組逡逑學、蛋白質組學等）的識別相互關聯(lián)，探究這些代謝物與宿主受體間的關系及作用機制逡逑是必要的。逡逑綜上所述，關于腸道菌群和腸道菌群代謝物的認識深化了對ＡＳ發(fā)病的病因和病理逡逑１６逡逑

逡逑＼／＇（＾§６：４０＇＇／。精確質量通過隨行的１＾１（８９［３７自動校準。（步驟見圖２）逡逑ＳａｍｏＪａ邋ｉｎｉｇｔ邐Ｌｏｎ邋ｍｏｂｉｌｉｔｙ邐ＭＳ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ逡逑Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ邐．、－．？、逡逑ｈｉ邋ｉ｜＂邋－ｍ逡逑—ｕ邋ｖＪＬ邐Ｄｎｆｔｔｌｍｅ邐＾邋ＲＴ逡逑0．邋？邋．；邐ＣＣＳ邋ｗ邋Ｔ逡逑暑逡逑Ｄａｔａ邋ａｎａｌｙｓｉｓ逡逑Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｔｐｉｄｓ邋ＰＣ．邋ＳＭ，邋ＰＧ，邋ＰＥ邐ＣｈｏＥ邋ａｎｄ邋ＴＧ逡逑｜％邋？邋■ｕｉｉ．ｉ．邋？逡逑ｉ＂Ｉｐｎ．：．丨邐逡逑０邐２邐４邐６邐８邐１０邐１２邐１４邐１６邐１８邐２０逡逑Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ邋ｔｉｍｅ邋（ｍｍ）逡逑圖２代謝組學實驗步驟逡逑１．４統(tǒng)計學分析逡逑臨床資料采用ＳＰＳＳ邋２０．０進行統(tǒng)計處理，所有計量資料均以（均數(shù)±標準差）表示，逡逑計數(shù)資料以頻數(shù)、百分數(shù)表示。計量資料的比較若符合正態(tài)性分布，并滿足方差齊性檢逡逑驗，采用ｔ檢驗，否則采用秩和檢驗，，汁數(shù)資料采用卡方檢驗。將質譜分析所得的原始逡逑數(shù)據(jù)導入配套的Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ邋Ｑ丨（Ｗａｔｅｒｓ，邋Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）工作站中，對色譜峰進行對齊，分逡逑組，峰共提取，去卷積后，將各批次所得數(shù)據(jù)用內標進行校正，軟件將自動運行并產生逡逑一個包含前體離子（ｍ／ｚ），保留時間和峰面積的矩陣。將產生的多元數(shù)據(jù)矩陣導入ＥＺｉｎｆｏ逡逑數(shù)據(jù)處理軟件屮進行偏最小二乘判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R259

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8 王保紅;李e

本文編號：2694730