【摘要】：目的:壯藥婦雅凈顆粒為本項目組前期研制的新制劑,前期研究發(fā)現(xiàn)該顆粒對大鼠盆腔炎性疾病后遺癥(sequelae of PID)治療效果好,能改善混合菌感染加機械損傷法建立的大鼠sequelae of PID癥狀,但其作用機制不明。本研究采用混合菌感染加機械損傷法建立可靠的sequelae of PID大鼠模型,給予相應量的壯藥婦雅凈顆粒治療,通過檢測對TNF-α、TL-10、NO、NOS、SOD、MDA、ICAM-1、NF-κB、NF-κBm RNA和ICAM-1 m RNA表達的影響,探討其對NF-κB信號通路的干預機制,為壯藥婦雅凈顆粒治療盆腔炎性疾病后遺癥的臨床治療提供實驗依據(jù)。方法:(1)壯藥婦雅凈顆粒的制備:按壯藥婦雅凈處方比例稱取藥材10Kg,加10倍60%乙醇回流提取2次,每次2小時,300目濾布過濾,濾液濃縮至稠浸膏,測定稠浸膏含固量,加入適量可溶性淀粉攪拌均勻,使每g理論干膏含原藥材2.33g,14-16目篩制粒,80℃鼓風干燥,14目篩整粒,按得膏率21%算,10kg應得浸膏2.1kg,按干膏含原藥量為2.33g藥材/g,應加輔料2.19kg。之后按每袋12g分裝,相當于含原藥材28g/袋。(2)建模:建立以混合菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以1:1的比例溶于無菌生理鹽水配成濃度為3×109個/m L的混合細菌懸液)加機械損傷制造的大鼠盆腔炎性疾病后遺癥模型組,大鼠腹腔打開不做任何處理隨機關腹縫合作為假手術組。在建模后第1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d取模型組、假手術組和空白對照組大鼠的全血、子宮做相應的血常規(guī)及病理切片。通過檢測的血常規(guī)及病理切片評判的統(tǒng)計分數(shù)來確定在造模后第幾天形成盆腔炎性疾病后遺癥癥模型。(3)取材、處理:大鼠建成盆腔炎性疾病后遺癥模型后,隨機分組:空白對照組、假手術組、模型組、花紅顆粒陽性組、地塞米松陽性組、壯藥婦雅凈顆粒高、中、低劑量組。建模后每隔一天給大鼠稱重,并給予15d的相應藥物治療及純水灌胃。在第15d灌胃1h后,將大鼠麻醉,取大鼠胸腺、脾臟、子宮稱重,并計算臟器系數(shù)值;全血一部分做血液流變學及血常規(guī),另一部分靜置離心取血清待測;將取出的子宮組織分為三部分:一部分用4%多聚甲醛浸泡,用于做病理切片和免疫組化;一部分取出后加一定體積的生理鹽水勻漿,取上清液備用;最后一部分迅速放入液氮中速凍,再放入-80℃凍存?zhèn)溆谩?4)采用WST-1法檢測sequelae of PID大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力,TBA法檢測血清中丙二醛(MDA)含量,硝酸還原酶法檢測血清中一氧化氮(NO)含量,用化學比色法測定一氧化氮合酶(NOS)活力。(5)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測sequelae of PID大鼠子宮組織液中IL-10、TNF-α含量。(6)免疫組化法檢測sequelae of PID大鼠子宮組織核因子-κB(NF-κB)和細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達。(7)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測sequelae of PID大鼠子宮組織核因子-κB信使RNA(NF-κBm RNA)和細胞間粘附分子-1信使RNA(ICAM-1 m RNA)表達。結(jié)果:(1)制得的壯藥婦雅凈顆粒呈棕黃色味微苦,按12g/袋分裝,批號為:20150726,存放于干燥器中,備用。(2)造模第14d模型組血液中白細胞數(shù)顯著升高(P0.01),中性粒細胞數(shù)顯著升高(P0.05),淋巴細胞顯著下降(P0.05)。病理HE染色切片觀察到,第14d宮腔擴張、腔壁結(jié)構改變,存在炎癥細胞浸潤。建模后大鼠體重急劇下降,在第五天左右開始恢復體重,給藥14天后,模型組子宮臟體比值較大但不顯著(P0.05),而胸腺比值、脾臟比值顯著較小(P0.01);模型組血常規(guī)中白細胞數(shù)顯著升高(P0.01),中性粒細胞數(shù)顯著升高(P0.01),淋巴細胞數(shù)顯著降低(P0.01),模型組子宮解剖形態(tài)學綜合評分顯著升高(P0.05)。表明造模后第14天形成盆腔炎性疾病后遺癥癥模型。(3)與空白對照組相比,模型組大鼠血清中SOD活力顯著下降(P0.01),血清中MDA含量、NO含量、NOS活力顯著升高(P0.05,P0.01,P0.05)。與模型組相比,壯藥婦雅凈顆粒組SOD活力顯著升高(P0.01);MDA含量顯著降低(P0.05);NO含量及NOS活力顯著降低(P0.01)。(4)與空白對照組比較,模型組大鼠子宮組織液中IL-10、TNF-α的濃度顯著升高(P0.01)。與模型組比較,壯藥婦雅凈顆粒組IL-10、TNF-α的濃度顯著降低(P0.01)。(5)與空白對照比較,模型組大鼠子宮組織NF-κB、ICAM-1免疫組化表達顯著升高(P0.01)。與模型組比較,壯藥婦雅凈顆粒組大鼠子宮組織NF-κB的表達顯著降低(P0.01);壯藥婦雅凈顆粒高劑量組(P0.01)、中和低劑量組(P0.05)大鼠子宮組織ICAM-1的表達顯著降低。(6)與空白對照組比較,模型組大鼠子宮組織NF-κBm RNA和ICAM-1m RNA的表達顯著升高(P0.05);與模型組比較,壯藥婦雅凈顆粒組大鼠子宮組織NF-κBm RNA、ICAM-1m RNA的表達顯著降低(P0.05)。結(jié)論:(1)壯藥婦雅凈顆粒新制劑的制備工藝簡單易行,有利于將來工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本實驗混合菌加機械損傷法建立盆腔炎性疾病后遺癥動物模型形成的初始時間為造模后第14d。(3)壯藥婦雅凈顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠NF-κB信號通路的干預機制為:上調(diào)大鼠體內(nèi)的抗炎因子SOD活力的水平,下調(diào)節(jié)炎癥因子MDA、NO、NOS,IL-10、TNF-α、NF-κB、ICAM-1、NF-κBm RNA、ICAM-1m RNA的水平,從而改善盆腔炎性疾病后遺癥的癥狀。
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【學位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R29

【參考文獻】

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本文編號：2331663