本文關(guān)鍵詞：二氫楊梅素激活AMPK對高糖誘導血管內(nèi)皮細胞損傷的抑制作用研究　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：最新研究資料顯示我國18歲以上成年人糖尿病(diabetes mellitus,DM)的患病率高達11.6%,已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后嚴重威脅我國居民健康的“第三殺手”。糖尿病患者常常由于其各種并發(fā)癥而導致病殘和死亡,其中最為常見的原因是血管病變,而血管內(nèi)皮細胞遭受高糖損傷是發(fā)生糖尿病血管并發(fā)癥的始動因素�；诖�,嚴格控制血糖水平是防治糖尿病血管并發(fā)癥的首選策略,然而現(xiàn)實生活中糖尿病患者的血糖控制有效率普遍偏低。因此,深入研究高糖損傷血管內(nèi)皮細胞的作用機制及相應的保護措施具有重要的理論價值和應用前景。大量研究證據(jù)表明單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是防治糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病的重要靶點,近年研究還發(fā)現(xiàn)AMPK信號通路對血管內(nèi)皮細胞功能也有重要調(diào)節(jié)作用。AMPK是由催化亞基α和調(diào)節(jié)亞基β、γ組成的異源三聚體。AMPK上游激酶通過磷酸化α亞基的172位蘇氨酸殘基(Thr172)激活AMPK。研究發(fā)現(xiàn)糖原可通過結(jié)合β亞基上的糖原結(jié)合域(glycogen-binding domain,GBD),引起AMPK活性的變構(gòu)抑制。糖原合成酶(glycogen synthase,GS)是調(diào)控糖原合成的關(guān)鍵酶,而蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)對GS活性具有重要調(diào)控作用。γ亞基可通過感知細胞內(nèi)AMP/ATP比值的變化從而引起AMPK活性的變構(gòu)調(diào)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)高糖對心肌細胞、內(nèi)皮祖細胞的損傷作用與其抑制上述細胞的AMPK活性密切有關(guān)。但是,AMPK在高糖誘導血管內(nèi)皮細胞損傷中的變化及其作用目前尚不清楚。藤茶(ampelopsis grossedentata)屬于葡萄科植物家族中的分支蛇葡萄屬,既可泡茶飲用又具藥理作用,在我國中南部的山區(qū)分布較廣,當?shù)厣贁?shù)民族將鮮嫩的藤茶莖葉炮制后飲用已有幾百年的歷史,并發(fā)現(xiàn)其對上呼吸道感染及肝炎等病癥有治療作用。黃酮類化合物二氫楊梅素的含量在干藤茶中的比重高達25%左右,二氫楊梅素已被證實具有改善脂類代謝和對抗炎癥、腫瘤等多種藥理功效,同時也是藤茶作為保健飲品發(fā)揮作用的主要活性成分。在前期實驗研究中我們證實楊梅素對高糖促發(fā)的血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷具有保護作用。而二氫楊梅素的分子結(jié)構(gòu)又與楊梅素極為相似,由此推測二氫楊梅素對高糖誘導血管內(nèi)皮細胞損傷可能也具有保護效應。本研究通過高糖處理原代人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷體外模型,通過細胞活力測定、流式細胞分析、蛋白免疫印跡、蒽酮-硫酸比色法、實時熒光定量PCR、化學發(fā)光、ELISA等技術(shù),探討AMPK活性變化在高糖誘導血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用及其調(diào)節(jié)機制,以及二氫楊梅素干預對高糖誘導血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用與機制,旨在為應用二氫楊梅素干預或飲用藤茶防治糖尿病血管并發(fā)癥提供實驗證據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:1、在高糖作用下,HUVECs細胞活力明顯下降,細胞凋亡率顯著增加,而二氫楊梅素干預可明顯抑制高糖誘導的HUVECs細胞活力下降和細胞凋亡增加,表明二氫楊梅素對高糖誘導HUVECs細胞損傷有明顯的保護作用。2、高糖處理的HUVECs細胞中AMPK及其下游靶蛋白ACC的磷酸化水平(p-AMPK、p-ACC)顯著降低,表明高糖抑制HUVECs細胞的AMPK活性。AMPK激動劑AICAR預處理可顯著抑制高糖誘導的HUVECs細胞活力下降及細胞凋亡增加;相反,AMPK活性抑制劑compound C則明顯抵消AICAR對高糖誘導的HUVECs細胞活力下降及細胞凋亡的保護作用,提示AMPK活性抑制參與了高糖誘導HUVECs損傷。3、與正常對照HUVECs細胞相比,二氫楊梅素處理的HUVECs細胞中的p-AMPK、p-ACC水平顯著升高,且高糖處理的HUVECs細胞經(jīng)二氫楊梅素干預后p-AMPK、p-ACC水平明顯回升,表明二氫楊梅素可拮抗高糖對HUVECs細胞AMPK活性的抑制作用。此外,AMPK活性抑制劑compound C明顯削弱二氫楊梅素對高糖誘導HUVECs細胞損傷的保護作用,提示二氫楊梅素通過激活AMPK抑制高糖誘導的HUVECs細胞損傷。4、高糖處理的HUVECs細胞與正常對照組細胞相比,細胞內(nèi)糖原含量顯著增加,GS m RNA及蛋白表達明顯升高,同時Akt和GSK3β蛋白的表達及其磷酸化水平增加,提示高糖可能通過Akt-GSK3β-GS通路促進HUVECs細胞糖原合成繼而抑制AMPK活性。5、二氫楊梅素處理的HUVECs與正常對照組細胞比較,細胞內(nèi)ATP含量顯著降低,同時ATP合成酶線粒體酶復合物F1F0-ATP合成酶活性明顯下降,提示二氫楊梅素可能通過抑制ATP合成酶活性降低細胞內(nèi)ATP的含量,繼而激活AMPK。綜上所述,高糖通過Akt-GSK3β-GS通路增加HUVECs細胞內(nèi)糖原含量抑制其AMPK活性,繼而引起HUVECs細胞損傷,而二氫楊梅素干預可通過抑制HUVECs細胞線粒體酶復合物F1F0-ATP合成酶活性、降低ATP的含量增加其AMPK活性,從而拮抗高糖對HUVECs細胞AMPK活性的抑制作用并保護高糖誘導的HUVECs細胞損傷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R259

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