本文關(guān)鍵詞：TAGLN2在食管鱗癌診斷和術(shù)后生存期預(yù)警中的臨床意義

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【摘要】：背景食管癌(Esophageal cancer,EC)發(fā)病率和死亡率分別居全球所有癌癥發(fā)病率和死亡率的第八位和第六位。中國(guó)每年EC新增及死亡患者居世界首位,食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占所有EC 90%以上。近幾十年來(lái),ESCC多學(xué)科綜合治療取得了巨大進(jìn)展,但ESCC預(yù)后差,外科根治性手術(shù)后五年生存率仍低于30%。ESCC預(yù)后差的主要原因是首次確診的ESCC時(shí)已發(fā)展至疾病的中晚期,并且50%的病人已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。TAGLN2(Transgelin2,轉(zhuǎn)凝蛋白)屬Calponin家族成員之一,是平滑肌22alpha(Smooth muscle 22alpha,SM-22α)的同源蛋白,TAGLN2蛋白參與細(xì)胞應(yīng)力纖維構(gòu)成,與肌動(dòng)蛋白相互作用維持其穩(wěn)定性。研究表明TAGLN2在肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌及頭頸鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),但在乳腺癌、肝細(xì)胞癌及食管腺癌中常低表達(dá)。Hippo信號(hào)通路是腫瘤抑制性通路之一,該通路失活能夠?qū)е翲ippo信號(hào)通路主要靶分子YAP、TAZ的活性升高,進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究分析了TAGLN2、YAP和TAZ在ESCC中的表達(dá)相關(guān)性,深入理解TAGLN2與ESCC臨床病理特征的相關(guān)性及在ESCC發(fā)生、演進(jìn)中的作用。目的分析TAGLN2在正常食管上皮細(xì)胞組織(Normal esophageal epithelium,NEE),低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織(Low grade intraepithelial neoplasia,LGIN),高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織(High grade intraepithelial neoplasia,HGIN)及不同TNM分期的ESCC組織中的表達(dá)特征,闡明TAGLN2表達(dá)變異與ESCC患者的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性及與ESCC根治性切除手術(shù)后整體生存率的關(guān)系,明確TAGLN2在ESCC發(fā)生及演進(jìn)中的作用;并分析TAGLN2與YAP、TAZ在ESCC中的表達(dá)相關(guān)性。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及組織食管上皮永生化細(xì)胞NEC、NE6及ESCC細(xì)胞系NE3、EC1、TE1、EC9706均來(lái)自河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;100例TNM I-IV期患者ESCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織(每期25例)均來(lái)自林州市腫瘤醫(yī)院病理科2010年-2012年底收集的組織樣本;162例五年隨訪(fǎng)ESCC術(shù)后患者,86例購(gòu)自上海芯超組織芯片公司,另76例來(lái)自河南大學(xué)附屬醫(yī)院淮河醫(yī)院2007年-2012年隨訪(fǎng)的ESCC患者,所有ESCC患者術(shù)前未接受任何化學(xué)治療或放射治療。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 RT-PCR分別提取ESCC各期及對(duì)應(yīng)癌旁組織mRNA,每期25對(duì),測(cè)mRNA濃度,反轉(zhuǎn)錄采用Promega A3800 Im Prom II?Reverse Transcription試劑盒進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 ul,包括Mg Cl2、5×buffer、引物、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶,在全自動(dòng)擴(kuò)增儀上將mRNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA;配制RT-PCR反應(yīng)體系20 ul,包括2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)、引物、DEPC水及c DNA,95℃解鏈、58℃退火、72℃延伸,定量檢測(cè)TAGLN2 mRNA在ESCC TNM各期組織及癌旁組織中的差異表達(dá)。1.2.2 Western blot所有組織及細(xì)胞均用2D裂解液提取蛋白,包括癌前病變各期組織蛋白(NEE、LGIN、HGIN各5例),ESCC(Ⅰ-Ⅳ期)及對(duì)應(yīng)癌旁組織各25對(duì)。細(xì)胞包括NEC、NE6、EC1、TE1、NE3、EC9706細(xì)胞系,Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。每孔30μg蛋白在SDS-PAGE中電泳分離各分子量蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1h,一抗按抗體推薦濃度TBST稀釋,4℃孵育過(guò)夜,二抗按推薦濃度TBST稀釋配制,室溫平搖1h,加增強(qiáng)型ECL發(fā)光劑曝片檢測(cè)目的條帶,Western blot結(jié)果半定量分析采用Quantity One軟件進(jìn)行。1.2.3免疫組織化學(xué)染色及半定量分析免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemical,IHC)方法檢測(cè)110例ESCC病變前各階段活檢組織和162例五年隨訪(fǎng)ESCC患者組織及癌旁組織中TAGLN2的差異表達(dá)。IHC染色評(píng)分首先根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。再根據(jù)免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占組織總細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分。最終兩次統(tǒng)計(jì)分值相乘,即為IHC分值。1.2.4穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建應(yīng)用慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)技術(shù)對(duì)NE6細(xì)胞過(guò)表達(dá)TAGLN2,對(duì)ESCC細(xì)胞系9706沉默TAGLN2,構(gòu)建亞細(xì)胞系NE6-T2及對(duì)照細(xì)胞、9706-sh-T2及對(duì)照細(xì)胞。1.2.5細(xì)胞核質(zhì)分離蛋白檢測(cè)參照NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞核質(zhì)分離,采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)蛋白。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS17.0軟件分析。T-test統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)兩組間差異,RT-PCR、Western blot檢測(cè)條帶及IHC檢測(cè)結(jié)果存在有序變量時(shí)采用Mann-whitney或Wilcoxon檢驗(yàn);卡方檢驗(yàn)的Gamma test檢驗(yàn)參數(shù)間的相關(guān)性;卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析ESCC患者臨床病理指標(biāo)與TAGLN2表達(dá)的相關(guān)性;Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn),各組間的比較采用Logrank檢驗(yàn),Cox回歸模型分析ESCC預(yù)后影響因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P0.05。2結(jié)果2.1 TAGLN2 mRNA在ESCC組織中高于相應(yīng)癌旁組織(P0.05),且TAGLN2 mRNA表達(dá)水平升高與ESCC發(fā)展存在正相關(guān)(P0.05),TAGLN2 mRNA表達(dá)水平隨著ESCC發(fā)展而升高。2.2從NEE發(fā)展至LGIN,再至HGIN病變,TAGLN2表達(dá)逐漸升高;隨ESCC臨床TNM分期進(jìn)展,TAGLN2的表達(dá)也逐漸升高;TAGLN2蛋白在食管上皮永生化細(xì)胞NEC、NE6中的表達(dá)均低于ESCC細(xì)胞系。2.3 IHC染色結(jié)果顯示TAGLN2在ESCC組織細(xì)胞中高表達(dá),主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中,在癌旁組織中呈低表達(dá);從NEE到LGIN,再?gòu)腖GIN到HGIN組織中TAGLN2的表達(dá)逐漸升高(P0.05),TAGLN2從HGIN到ESCC中表達(dá)差異不明顯;TAGLN2表達(dá)水平與ESCC癌前病變進(jìn)展及ESCC各期進(jìn)展呈正相關(guān);TAGLN2蛋白表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)(P0.05);而與性別、年齡、T-stage、分化程度無(wú)顯著相關(guān)性(P0.05)。2.4 TAGLN2及各臨床病理資料與根治性手術(shù)后生存期的相關(guān)性TAGLN2表達(dá)升高與ESCC患者術(shù)后五年總體生存率呈負(fù)相關(guān)(P0.05);在TNMⅠ-Ⅱ期ESCC中TAGLN2表達(dá)升高與患者術(shù)后五年生存率呈正相關(guān)(P0.05),而在TNMⅢ-Ⅳ期TAGLN2的表達(dá)與ESCC患者術(shù)后五年總體生存率無(wú)顯著相關(guān)性(P0.05)。2.5影響ESCC預(yù)后的單因素、多因素分析單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示:患者性別、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、TAGLN2表達(dá)水平是影響ESCC患者術(shù)后總體生存期的重要因素(P0.05),還不能認(rèn)為年齡、病理分期能影響ESCC術(shù)后總體生存期(P0.05);Cox多因素回歸分析顯示:TAGLN2是ESCC術(shù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P0.05),性別、浸潤(rùn)深度分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、臨床TNM分期尚不能認(rèn)為是ESCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P0.05)。2.6 TAGLN2與YAP/TAZ相關(guān)性YAP、TAZ蛋白在ESCC組織中表達(dá)高于癌旁組織,T檢驗(yàn)蛋白條帶的半定量分析顯示差異顯著(P0.05)。TAZ與TAGLN2同時(shí)在癌中升高比例達(dá)75%,YAP與TAGLN2同時(shí)升高比例達(dá)到62.5%,表明TAGLN2與YAP、TAGLN2與TAZ存在正相關(guān)性。NE6-T2及9706-sh-T2亞細(xì)胞系與其對(duì)應(yīng)對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)YAP/TAZ蛋白相比顯著降低。3結(jié)論3.1 TAGLN2表達(dá)變異發(fā)生于ESCC癌前病變,并隨ESCC發(fā)展逐漸升高,TAGLN2可能是ESCC分子診斷、預(yù)防和治療分子靶點(diǎn)之一;3.2 TAGLN2表達(dá)水平與ESCC的臨床分期呈正相關(guān),與ESCC術(shù)后五年總體生存率存在負(fù)相關(guān),且是ESCC術(shù)后生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。TAGLN2可能是ESCC術(shù)后生存期預(yù)警評(píng)估分子之一。3.3 TAGLN2與Hippo信號(hào)通路中的靶分子YAP和TAZ表達(dá)呈正相關(guān)性,且TAGLN2促進(jìn)YAP/TAZ入核。TAGLN2可能通過(guò)影響YAP和TAZ的入核增多促進(jìn)了ESCC演進(jìn)。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細(xì)胞癌 TAGLN2 預(yù)后 YAP TAZ
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-15
• 縮略詞表15-16
• 前言16-20
• 1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器20-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)研究所用的細(xì)胞及組織20
• 1.2 使用主要試劑及配制20-26
• 1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器26-28
• 2.實(shí)驗(yàn)方法28-36
• 2.1 蛋白提取28
• 2.2 蛋白濃度檢測(cè)28
• 2.3 WESTERN BLOT檢測(cè)大分子蛋白（>15KB）28-30
• 2.4 WESTERN BLOT檢測(cè)小分子蛋白（<15KB）30
• 2.5 組織及細(xì)胞RNA提取30-31
• 2.6 RNA反轉(zhuǎn)錄31
• 2.7 瓊脂糖凝膠電泳31
• 2.8 RT-PCR31-32
• 2.9 免疫組織化學(xué)染色32
• 2.10 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分32-33
• 2.11 慢病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定亞細(xì)胞株33
• 2.12 細(xì)胞核質(zhì)分離檢測(cè)33
• 2.13 統(tǒng)計(jì)分析33-36
• 3 結(jié)果36-50
• 3.1 TAGLN2 mRNA在ESCC患者各期組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的差異表達(dá)36-37
• 3.2 WESTERN BLOT檢測(cè)TGALN2在正常食管黏膜、癌前病變及各臨床分期ESCC中的表達(dá)37-38
• 3.3 IHC檢測(cè)TGALN2在正常食管黏膜、癌前病變及各臨床分期ESCC中的表達(dá)38-42
• 3.4 TAGLN2與術(shù)后生存時(shí)間的相關(guān)性42-44
• 3.5 COX單因素及多因素統(tǒng)計(jì)分析影響ESCC病人根治性術(shù)后不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素44-45
• 3.6 TAGLN2、YAP和TAZ在食管上皮永生化細(xì)胞及癌細(xì)胞系中的表達(dá)45-46
• 3.7 ESCC組織中TAGLN2與YAP、TAZ間的相關(guān)性46-47
• 3.8 TAGLN2促進(jìn)食管正常永生化上皮細(xì)胞NE6及ESCC細(xì)胞系9706中YAP/TAZ入核47-50
• 4 討論50-54
• 5 結(jié)論54-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 綜述 Hippo信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生及演進(jìn)的研究進(jìn)展62-78
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 致謝78-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文及獲得獎(jiǎng)勵(lì)情況80-81

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