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TLR7激動劑Loxoribine抑制腫瘤生長的免疫學機制研究

發(fā)布時間:2017-09-28 07:30

  本文關鍵詞:TLR7激動劑Loxoribine抑制腫瘤生長的免疫學機制研究


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【摘要】:目的:腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制性細胞,其中調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Tregs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Tregs在不同腫瘤中的表達都有不同程度的增高,諸如肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均發(fā)現(xiàn)有這群細胞的存在,腫瘤局部Tregs的數(shù)量與腫瘤的預后密切相關。Tregs通過多種機制誘導免疫抑制效應,是腫瘤免疫逃逸的重要調控因素,因此抑制Tregs的免疫抑制效應是免疫治療的關鍵步驟。本課題通過CT26小鼠結腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌模型,探討了TLR7受體的激動劑Loxoribine抑制腫瘤生長的免疫學機制。方法:1)通過CT26小鼠結腸癌細胞和LLC lewis小鼠肺癌細胞構建荷瘤小鼠模型,模型構建成功后,以每只荷瘤小鼠1umol的Loxoribine進行腹腔注射,對照組注射PBS(9.8%DMSO),隔3天注射1次,持續(xù)3周。觀察Loxoribine對小鼠體內腫瘤生長的影響。2)通過細胞增殖實驗(CCK8)檢測Loxoribine對CT26小鼠結腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞是否有直接殺傷作用。3)通過RT-PCR檢測TLR7在CT26小鼠結腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞中是否表達。4)SCID小鼠是一種缺乏T淋巴細胞和B淋巴細胞的免疫缺陷小鼠,但先天免疫完整。為了明確Loxoribine是否通過激活先天免疫發(fā)揮抑制腫瘤的作用,進一步構建CT26小鼠結腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌的SCID小鼠荷瘤模型,然后分別以Loxoribine和PBS(9.8%DMSO)進行腹腔注射,隔3天注射1次,持續(xù)3周。觀察Loxoribine是否抑制體內腫瘤的生長,以明確Loxoribine是否通過激活先天免疫發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。5)通過磁珠分選(MACS)的方法分選出CT26小鼠結腸癌荷瘤小鼠、LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠以及對照小鼠脾臟、骨髓中CD4+T細胞,DCs和Tregs,通過淋巴細胞增殖實驗檢測Loxoribine處理后對淋巴細胞增殖的影響。6)通過MACS分選TLR7基因敲除小鼠(TLR7-/-)和對照組小鼠脾臟、骨髓中CD4+T細胞,DCs和Tregs,經(jīng)Loxoribine刺激后檢測其對淋巴細胞增殖的影響。7)通過流式細胞術檢測Loxoribine對DCs成熟的影響。8)建立Transwell共培養(yǎng)體系(上層加入Tregs,下層加入DCs),在共培養(yǎng)體系中加入Loxoribine觀察其對DCs細胞因子分泌的影響。9)使用ELISA方法對Loxoribine處理后的DCs進行細胞因子分泌量的檢測并使用相應細胞因子的中和抗體進行中和,驗證該細胞因子的作用。將Loxoribine處理后的DCs對小鼠靜脈注射,觀察其對小鼠腫瘤生長的抑制作用。結果:1)通過CT26小鼠結腸癌和LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤模型發(fā)現(xiàn),與PBS(9.8%DMSO)注射組相比,Loxoribine注射組小鼠皮下腫瘤生長顯著緩慢,表明Loxoribine能夠抑制腫瘤的體內生長。2)RT-PCR結果顯示,CT26小鼠結腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞中均不表達TLR7。通過細胞增殖實驗(CCK8)發(fā)現(xiàn),Loxoribine對CT26小鼠結腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞無直接殺傷作用。3)通過SCID免疫缺陷小鼠荷瘤模型發(fā)現(xiàn),Loxoribine處理組和對照組小鼠體內腫瘤生長無顯著性差別,表明Loxoribine并不是通過激活先天性免疫而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。4)通過MACS分選荷瘤組和對照組小鼠體內CD4+T細胞,DCs和Tregs,淋巴細胞增值實驗結果顯示,與未經(jīng)Loxoribine處理的荷瘤小鼠和對照組小鼠相比,使用Loxoribine處理后的荷瘤小鼠體內Tregs不能抑制CD4+T細胞的增殖。5)淋巴細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn),當CD4+T細胞,Tregs或DCs單獨培養(yǎng)時,Loxoribine對其增殖沒有直接影響;然而當CD4+T/DCs或Tregs/DCs混合培養(yǎng),Loxoribine可以明顯促進CD4+T細胞或Tregs的增殖,而對CD4+T/Tregs混合培養(yǎng)組細胞的增殖沒有影響,表明TLR7的激動劑Loxoribine通過DCs促進CD4+T細胞和Tregs增殖。6)在CD4+T/DCs/Tregs的培養(yǎng)體系中加入Loxoribine發(fā)現(xiàn),Loxoribine逆轉Tregs對CD4+T細胞的抑制作用,而這一作用是通過DCs介導的。7)分選野生型和TLR7基因敲除小鼠體內CD4+T細胞、DCs和Tregs,通過淋巴細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn),TLR7在DCs中的表達是Loxoribine促進CD4+T細胞增殖和逆轉Tregs免疫抑制功能所必需的。8)流式細胞術分析結果顯示Loxoribine對DCs上CD80、CD86等分子表達沒有影響,表明Loxoribine不能誘導DCs的成熟。8)ELISA結果顯示,Loxoribine可以促進DCs分泌多種細胞因子,其中IL-6表達變化最為明顯,中和IL-6表達后可以顯著抑制Loxoribine對CD4+T細胞和Tregs的作用,表明DCs通過分泌IL-6調控Tregs。9)將Loxoribine處理的DCs靜脈注射荷瘤小鼠后,可以顯著抑制腫瘤的生長。結論:Loxoribine能顯著抑制CT26小鼠結腸癌細胞和LLC Lewis小鼠肺癌細胞在體內的生長,這種抑制效應并不是通過直接殺傷作用和激活先天性免疫而實現(xiàn),而是通過DCs釋放可溶性細胞因子IL-6促進CD4+T細胞的增殖并逆轉Tregs的免疫抑制功能。
【關鍵詞】:TLR7 調節(jié)性T細胞 免疫抑制 抑瘤效應
【學位授予單位】:上海交通大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2015
【分類號】:R730.5
【目錄】:
  • 摘要6-9
  • Abstract9-12
  • 英文縮略語表12-14
  • 緒論14-17
  • 第一部分 Loxoribine抑制結腸癌和肺癌在體內的生長17-34
  • 引言17-18
  • 材料與方法18-26
  • 結果26-31
  • 討論31-34
  • 第二部分 Loxoribine通過DCs促進CD4+T細胞增殖和逆轉Tregs的免疫抑制功能34-48
  • 引言34
  • 材料與方法34-39
  • 結果39-45
  • 討論45-48
  • 第三部分 Loxoribine通過DCs釋放IL-6 來發(fā)揮作用48-61
  • 引言48
  • 材料與方法48-55
  • 結果55-59
  • 討論59-61
  • 結論61-62
  • 參考文獻62-68
  • 致謝68-70
  • 已發(fā)表文章70

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8 李U,

本文編號:934613


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