本文關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌HepG2中p53調(diào)控microRNA的表達(dá)譜構(gòu)建和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

  更多相關(guān)文章： p53 microRNA 小RNA測(cè)序 肝細(xì)胞癌 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

【摘要】：p53作為腫瘤抑制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor, TF),在DNA損傷等細(xì)胞壓力下被激活并介導(dǎo)參與多種腫瘤相關(guān)生物學(xué)過(guò)程,如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲和遷移等。作為腫瘤抑制因子,野生型p53蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游與腫瘤相關(guān)基因表達(dá),抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。MicroRNA(miRNA)是一類由21-24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性小非編碼RNA,最近研究已證實(shí)miRNA可受p53蛋白直接調(diào)控并參與到多個(gè)p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之中。然而,目前在肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)中p53調(diào)控miRNA表達(dá)譜以及p53-miRNA參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。本文利用抗癌藥物阿霉素(Doxorubicin, Dox)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA損傷,激活p53信號(hào)通路。通過(guò)小RNA測(cè)序(Small RNA sequencing, small RNA-seq)檢測(cè)阿霉素處理肝癌細(xì)胞HepG2前后miRNA的差異表達(dá)情況,利用Targetscan、miRanda和’Tarbase軟件對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并使用GO與KEGG通路富集方法對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行功能富集分析。隨后通過(guò)整合分析p53 ChIP-seq與miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription start site, TSS)數(shù)據(jù),識(shí)別miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游10kb和下游1 kb假定啟動(dòng)子區(qū)域是否存在p53蛋白結(jié)合位點(diǎn),篩選出潛在受p53直接調(diào)控的miRNAs。最后選擇感興趣并在肝細(xì)胞癌中未曾報(bào)道的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)p53-miRNA表達(dá)變化,并利用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)檢測(cè)miRNA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示在阿霉素誘導(dǎo)的DNA損傷條件下,HepG2細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。經(jīng)過(guò)兩次生物學(xué)重復(fù)小RNA測(cè)序,共篩選出33條顯著差異表達(dá)miRNAs,其中12條miRNAs上調(diào),21條miRNAs表達(dá)下調(diào)。MiR2Disease疾病功能分析發(fā)現(xiàn)其中有8條miRNAs與肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相關(guān)。GO和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示87.6%和90.9% miRNAs的靶基因分別參與到p53介導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)程與信號(hào)通路中。MiRNA啟動(dòng)子區(qū)p53結(jié)合位點(diǎn)分析顯示,33條顯著差異表達(dá)miRNAs中有18條miRNAs具備p53蛋白潛在結(jié)合位點(diǎn),其中有7條miRNAs的啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)p53蛋白結(jié)合位點(diǎn),這意味著這些miRNA可能受p53的直接調(diào)控。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證肝細(xì)胞癌中未曾報(bào)道的差異表達(dá)miR-3661和miR-4521,結(jié)果顯示miR-3661表達(dá)量上調(diào)10.17倍,miR-4521表達(dá)量下調(diào)6.25倍,與測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。隨后探討了p53誘導(dǎo)顯著上調(diào)的miR-3661對(duì)HepG2增殖的影響,發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-3661抑制HepG2細(xì)胞的增殖,抑制率為25.7%(P0.01)。最后構(gòu)建和分析肝癌細(xì)胞HepG2在癌癥通路(Pathways in cancer)的p53-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并對(duì)網(wǎng)絡(luò)中64條p53-miRNA-mRNA前反饋回路進(jìn)行了分析。
【關(guān)鍵詞】：p53 microRNA 小RNA測(cè)序 肝細(xì)胞癌 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-12
• 第1章 緒論12-23
• 1.1 p53與腫瘤12-15
• 1.1.1 p53結(jié)構(gòu)與功能12-14
• 1.1.2 p53與DNA損傷14
• 1.1.3 p53介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)生物進(jìn)程和信號(hào)通路14-15
• 1.2 MicroRNA與腫瘤15-18
• 1.2.1 miRNA生物學(xué)合成與作用機(jī)制15-17
• 1.2.2 miRNA生物學(xué)功能17
• 1.2.3 miRNA與腫瘤17-18
• 1.3 p53與microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)18-20
• 1.3.1 p53-microRNA調(diào)控18-19
• 1.3.2 p53-microRNA網(wǎng)絡(luò)研究進(jìn)展19-20
• 1.4 課題研究目的、意義和內(nèi)容20-23
• 1.4.1 本課題的研究目的和意義20
• 1.4.2 本課題的研究?jī)?nèi)容20-22
• 1.4.3 本課題創(chuàng)新點(diǎn)22-23
• 第2章 肝癌細(xì)胞中DNA損傷誘導(dǎo)下p53調(diào)控microRNA的高通量篩選23-48
• 2.1 材料與方法23-32
• 2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與阿霉素藥物處理23-25
• 2.1.2 mRNA水平檢測(cè)DNA損傷應(yīng)激條件下p53與p21表達(dá)變化25-28
• 2.1.3 蛋白水平檢測(cè)DNA損傷應(yīng)激條件下p53表達(dá)情況28-30
• 2.1.4 小RNA測(cè)序樣品的制備30-31
• 2.1.5 sRNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序數(shù)據(jù)分析31-32
• 2.1.6 差異表達(dá)miRNA篩選32
• 2.1.7 miRNA的疾病功能分析32
• 2.2 結(jié)果與分析32-46
• 2.2.1 DNA損傷應(yīng)激條件下p53與下游靶基因表達(dá)活化32-37
• 2.2.2 小RNA測(cè)序樣本總RNA純度及完整性鑒定37-38
• 2.2.3 小RNA長(zhǎng)度分布、堿基偏好性和染色體分布特征38-41
• 2.2.4 HepG2細(xì)胞中受p53調(diào)控的差異表達(dá)miRNA篩選41-44
• 2.2.5 mir2disease介導(dǎo)的疾病功能分析44-46
• 2.3 討論46-47
• 2.4 本章小結(jié)47-48
• 第3章 p53調(diào)控差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)與功能分析48-66
• 3.1 材料與方法48-52
• 3.1.1 miRNA靶基因預(yù)測(cè)48
• 3.1.2 Gene Ontology和KEGG通路富集分析48-49
• 3.1.3 p53結(jié)合位點(diǎn)ChIP-seq數(shù)據(jù)分析49
• 3.1.4 p53-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建49
• 3.1.5 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證49-51
• 3.1.6 miR-3661對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響51-52
• 3.2 結(jié)果與分析52-64
• 3.2.1 miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果52
• 3.2.2 GO功能注釋結(jié)果52-54
• 3.2.3 KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果54-56
• 3.2.4 p53-miRNA結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別56-58
• 3.2.5 p53-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建58-60
• 3.2.6 差異表達(dá)miRNA qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果60-62
• 3.2.7 miR-3661抑制HepG2細(xì)胞增殖62-64
• 3.3 討論64-65
• 3.4 本章小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-67
• 致謝67-68
• 參考文獻(xiàn)68-77
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文77

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本文編號(hào)：913576