本文關鍵詞：Procaspase-8靶向腫瘤特異性藥物篩選穩(wěn)定細胞系的構建

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【摘要】：腫瘤的發(fā)生是一種復雜無序的過程,其發(fā)生機理和原因多種多樣,有先天遺傳因素,也有后天外界因素。正是由于它的復雜多變,致使癌癥仍然至今仍是世界醫(yī)學界的一個難題。隨著人類醫(yī)學水平的不斷進步,越來越多的方法手段被應用到了癌癥的治療中。癌癥傳統(tǒng)治療方式的缺點與不足,使生物靶點治療成為了新一代研究的熱點。TRAIL(Tumor necrosis factot-related apoptosis-inducing ligand,腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體)是TNF-α相關的細胞因子家族成員,由于其對正常細胞無傷害和對腫瘤細胞選擇性誘導凋亡,使TRAIL成為腫瘤治療的潛力藥物。然而TRAIL的生產成本及其保存運輸所需的花費開銷十分巨大,因此開發(fā)TRAIL類似活性的小分子化合物是非常必要的。天然產物是一個很大的化合物庫,但是如何從海量的天然產物中找到TRAIL的功能類似物仍是一個難題。由美國Canon創(chuàng)立的一種分子熒光標記技術配體-受體-募集物復合體熒光成像REFI給這一難題帶來福音,用綠色熒光蛋白GFP標記β-Arresting檢測G蛋白偶聯(lián)受體的活化。同樣我們可以利用該技術根據(jù)配體-受體-募集物復合體熒光成像技術的成功思路,來標記細胞中TRAIL引發(fā)凋亡通路中的蛋白Procaspase-8,若加入的天然提取物在細胞中能引起與加入TRAIL時相同的變化,則該提取物中可能存在與TRAIL有類似功能的替代物。因此,以該靶點構建篩藥平臺的穩(wěn)定細胞系成為這一方法的關鍵所在。云南動植物資源豐富,是天然的藥物資源庫,該方法為TRAIL替代物的發(fā)現(xiàn)篩選提供了可靠的工具。為了避免Procaspase-8的過表達導致細胞凋亡,且同時能使用分子熒光標記技術篩選藥物,將Procaspase-8后面的募集信號凋亡的蛋白區(qū)域去掉,只選擇與FADD結合的區(qū)域Procase-8DED 1(1-84)(Prc8DED 1)的前84個氨基酸組成的小肽,如此既避免了轉染細胞的凋亡,同時也能通過GFP熒光觀測prc8DED 1的熒光募集變化。該細胞模型目前已初步構建成功。本實驗的任務是摸清加入陽性藥物后細胞的反應變化,及加入藥物的最佳時間和濃度；以及利用第三代基因編輯技術CRISPR/Cas9技術進一步敲除內源性Procaspase-8,以達到排除內源性Procaspase-8競爭結合DR4.DR5,優(yōu)化已構建的篩選細胞模型的目的。實驗內容與結果：1、利用分子生物學手段成功構建出細胞系U20S-Prc8DED1-GFP,將細胞消化懸浮后種入96孔L板中,設置濃度梯度和時間梯度,確定已構建細胞系U20S-Prc8DED1-GFP的正確性以及對藥物TRAIL的敏感程度條件。用藥物TRAIL處理后,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細胞綠色熒光開始發(fā)生凝聚,約30 min后,綠色熒光恢復原來舒展狀態(tài),說明該細胞系對藥物TRAIL有應激性。2、為了進一步優(yōu)化細胞系U20S-Prc8DED1-GFP,避免內源性Procaspase-8對細胞表面受體DR4/5的競爭性結合,利用第三代基因編輯技術CRISPR/Cas9將內源性Procaspase-8敲除,針對目標靶序列設計構建Guide-RNA.Donor DNA,通過電轉共轉進細胞U20S-PrcDED 1-GFP當中,篩選出帶有紅光的單克隆細胞,并加藥檢測細胞；結論：已初步確認細胞系U20S-PrcDED 1-GFP對藥物TRAIL有一定的應激性,CRISPR/Cas9敲除技術質粒已構建完備,目前正在轉染檢測細胞的過程當中。
【關鍵詞】：Procaspase-8 細胞凋亡 CRISPR/Cas9 TRAIL
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 縮略表12-16
• 第一章 緒論16-26
• 1.1 Procaspase-8與DISC信號通路16-18
• 1.2 以TRAIL為激動劑的抗腫瘤靶向的藥物篩選18-19
• 1.3 受體效應復合物熒光成像技術(REFI)19
• 1.4 U2OS-Prc8DED1-GFP的構建機制19-20
• 1.5 新的基因編輯技術--CRISPR/Cas920-22
• 1.6 CRISPR/Cas9的應用前景22
• 1.7 研究目的22-23
• 1.8 研究路線23-26
• 1.8.1 細胞系U2OS-Prc8DED1-GFP鑒定方法23
• 1.8.2 優(yōu)化篩選細胞系U20S-Prc8DED1-GFP23-26
• 第二章 U2OS-Prc8DED1-GFP細胞系的驗證26-58
• 2.1 實驗材料及試劑配制27-38
• 2.1.1 載體、菌種及細胞27-28
• 2.1.2 實驗儀器和耗材28-30
• 2.1.3 實驗試劑和藥品30-32
• 2.1.4 實驗試劑的準備32-38
• 2.2 實驗內容與結果38-58
• 2.2.1 細胞實驗38-42
• 2.2.2 高內涵顯微鏡下拍攝觀察42-45
• 2.2.3 圖片結果分析45-48
• 2.2.4 查找影響因素,優(yōu)化細胞系U2OS-Prc8DED1-GFP48-56
• 2.2.5 分析討論56-58
• 第三章 內源性Procaspase-8的敲除58-92
• 3.1 實驗思路及流程59-60
• 3.2 實驗材料60
• 3.2.1 載體、菌種及細胞60
• 3.2.2 實驗儀器和耗材60
• 3.2.3 實驗試劑及藥品60
• 3.2.4 實驗試劑配制60
• 3.3 實驗內容及結果分析60-92
• 3.3.1 質粒構建60-86
• 3.3.2 細胞轉染86-90
• 3.3.3 單克隆細胞篩選90-91
• 3.3.4 藥物驗證91-92
• 第四章 討論與總結92-94
• 參考文獻94-106
• 致謝106-107
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄107

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