本文關鍵詞：靶向舌鱗癌細胞高分子超聲造影劑的制備及體外尋靶實驗

  更多相關文章： 聚乳酸/羥基乙酸共聚物 超聲微泡 靶向舌鱗癌細胞 分子成像

【摘要】：舌鱗狀細胞癌(Tongue squamous cell carcinoma, TSCC)患者早期易發(fā)生頸部淋巴結轉移,明顯影響其預后,并決定腫瘤分期及治療方案。于是及時診斷及治療舌癌患者頸部轉移淋巴結成為提高生存率的迫切需求。基于臨床上尚無一種可靠客觀的無創(chuàng)性檢查和治療手段。第4代聲學造影劑由于具備有靶向診斷和靶向給藥的功能成為診療舌癌原發(fā)灶及其頸部淋巴道轉移灶的探索方向。其中,高分子聚合物作為第4代超聲造影劑(Ultrasound contrast agent, UC A)外殼材料之一,聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(Lactic-co-glycolic acid), PLGA]具備優(yōu)異的生物相容性、可控生物降解性、良好的成球或成膜性能以及增加藥物和DNA投遞和定位的功效優(yōu)勢。TATp(transactivating transcriptional activator protein from human immunodeficiency virus type 1, HIV-1 TAT)人類免疫缺陷病毒的反式轉錄活化因子作為細胞穿膜肽之一,能將載藥超聲微泡(Ultrasound microbubble, UM)迅速、高效和安全的帶入并滯留在細胞內部。但TATp缺乏細胞特異性。趨化因子SDF-1 (stromal cell-deried factor 1)又名為CXCL12,其唯一能與之結合并激活的受體為CXCR4,遠高表達于出現轉移淋巴結(Metastatic lymph node, MLN)的舌鱗癌細胞膜上,在不同口腔鱗癌細胞中陽性表達率高達72.3%～89.6%。而凋亡素蛋白(apoptin或VP3)由雞貧血病毒(Chicken anemia virus, CAV)基因編碼,具有腫瘤細胞特異性。對正常細胞無毒性,也同時具有一定靶向性。采用乳化溶劑揮發(fā)法(WI/O/W2)制備出靶向載藥PLGA的UM,由于受到制備配方中多步驟的限制,仍然存在載藥量(Drug loading,DL)較低問題,于是優(yōu)化制備工藝成為必須。綜上,本課題主要旨在制備一種TATp與SDF-1修飾的新型載VP3基因靶向高分子UM,并優(yōu)化制備工藝,提高載藥量。通過體外尋找舌scc-15細胞,驗證所制得的UCA靶向性,從而為舌癌原發(fā)灶及其頸部淋巴道轉移組織的無創(chuàng)早期診斷和非手術治療提供一種新思路和新手段。本實驗分以下兩部分：第一部分靶向舌鱗癌細胞載基因超聲微泡的制備及其優(yōu)化目的：1.制備一種載VP3基因,并TATp與SDF-1同時修飾新型載基因高分子靶向UCA。并探討制備因素對其粒徑、載藥量、包封率等.影響,從而篩選出制備UM的最佳組合。2.評價該靶向UCA基本特性、對DNA保護性、體外釋放效果、分子成像效果以及TATp、SDF-1在高分子UM表面連接狀況。方法：1.采用WI/O/W2法及真空冷凍干燥法制備載VP3基因PLGA的UM,并使用單因素和正交分析實驗優(yōu)化其制備條件,提高載藥量。并通過硫醚鍵將SDF-1與TATp同時共價聯接到微泡表面,制備出靶向舌鱗癌細胞載VP3基因PLGA的UM(TATp-SDF-1-VP3-PLGA-UM,TSVP-UM)。2.普通光學顯微鏡觀察該UM形態(tài)以及分散性；Nano-Drop紫外分光光度計評估其載藥量及包封率；透射電鏡觀察其內部結構；Malvern測量儀測定其粒徑以及分布、表面電位；流式細胞儀(Flow cytometry, FC)及激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)檢測TATp、 SDF-1在高分子UM表面連接狀況；酶切反應實驗鑒定其對DNA保護性；Nano-Drop紫外分光光度計檢測其體外釋藥性能；彩色多普勒超聲成像診斷儀評價其體外成像效果。結果：1.使用單因素和正價分析所得最佳制備方案為VP3基因/PLGA質量比為1.6%,VP3基因濃度為8ug/ul,水相／油相體積比(W1/O)為1：15。2.靶向載基因UM呈規(guī)則球形,分散性好。粒徑分布集中,大小以490.2-522.6nm之間為主,表面電位為-17-0mv。平均載藥量為0.86%,平均包封率為40.47%。對DNA保護作用持續(xù)60min,未見損壞。長達24天緩慢持久釋放VP3基因。單獨TATp、SDF-1與PLGA微泡表面連接率分別為98.37%、97.07%。同時加載TATp、SDF-1于PLGA微泡表面的連接率,TATp為69,84%、SDF-1為71.08%。體外超聲成像效果較好。結論：通過優(yōu)化制備工藝及化學硫醚鍵聯接成功制備出TSVP-UM。該UM粒徑滿足靜脈給藥需求,并具有載藥量較高、長效緩釋、體外成像效果較好的特性,兼具診斷和治療的理想載藥超聲造影劑系統(tǒng)的基本性能。第二部分靶向舌鱗癌細胞載基因超聲微泡制備及體外尋靶實驗實驗研究目的：按照優(yōu)化方案制備TSVP-UM。并初步探討其體外尋靶性能。方法：1.體外培養(yǎng)SCC-15細胞,接種6孔板,制備細胞爬片。2.按優(yōu)化參數制備靶向組TSVP-UM,以及非靶向組載VP3基因高分子超聲微泡(VP3-PEG-PLGA-UM, VPP-UM)。與細胞爬片共孵育30min～1h。3.光鏡下比較觀察兩組UM與SCC-15細胞結合情況,流式細胞儀量化兩者結合律。結果：1.光鏡觀察顯示,靶向微泡組TSVP-UM簇聚化SCC-15細胞膜區(qū)域,少量已穿過細胞膜進入到胞質內部。而非靶向組VPP-UM較少粘附與細胞膜上。2.流式細胞儀半定量結果表明,靶向組聯接率為91.44%,非靶向組為12.96%。結論：體外尋靶驗證了TSVP-UM對SCC-15細胞具備較強靶向性。并且同時發(fā)現在較短時間內,TSVP-UM已少許穿膜進入到SCC-15細胞內部。初步驗證了TSVP-UM殼層聯接的TATp的生物活性。TSVP-UM作為一種非病毒基因載體有望成為一類作用于舌SCC及其淋巴道轉移組織、安全有效的基因傳遞系統(tǒng)。
【關鍵詞】：聚乳酸/羥基乙酸共聚物 超聲微泡 靶向舌鱗癌細胞 分子成像
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-19
• 第一部分 靶向舌鱗癌細胞載基因超聲微泡的優(yōu)化制備及評估19-40
• 第一節(jié) 靶向舌鱗癌細胞載VP_3基因高分子超聲微泡的制備及特性檢測19-28
• 1 材料與方法19-23
• 2 結果23-28
• 第二節(jié) 靶向舌鱗癌細胞載VP_3基因高分子超聲微泡制備優(yōu)化及特性檢測28-40
• 1 材料與方法28-33
• 2 結果33-38
• 3 討論38-40
• 第二部分 TATp和CXCR4修飾的載VP3基因超聲微泡體外導靶實驗研究40-47
• 1 材料與方法40-45
• 2 結果45-46
• 3 討論46-47
• 全文總結47-49
• 參考文獻49-55
• 附圖55-56
• 文獻綜述56-65
• 參考文獻62-65
• 致謝65-66
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文66

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 嚴文洪,唐峰,張孟殷;舌鱗癌微血管密度的研究[J];上海醫(yī)學;2001年09期

2 朱永學,黃彩萍,吳毅;早期舌鱗癌的隱匿性淋巴結轉移與治療[J];中國癌癥雜志;2001年02期

3 曾曙光,陳偉良;一氧化氮在舌鱗癌血管生成中的作用[J];中山醫(yī)科大學學報;2002年05期

4 李秋梨,陳福進,曾宗淵,楊安奎,吳秋良,張惠忠,伍國號,許光普,郭朱明,張詮;舌鱗癌隱匿性頸淋巴結轉移與臨床病理相關因素的關系[J];癌癥;2003年01期

5 楊亦萍,卿海云,曹陽;舌鱗癌預后與細胞增殖和凋亡的關系[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2003年01期

6 曾曙光,艾偉健,陳偉良;血管內皮生長因子表達及微血管密度在舌鱗癌侵襲性生長中的意義[J];廣東牙病防治;2004年01期

7 阮敏,王元銀,陳喬爾,王銀龍,何家才,周健;舌鱗癌環(huán)氧化酶-2的表達及臨床意義[J];安徽醫(yī)科大學學報;2004年05期

8 萬宏坤;舌鱗癌頸部淋巴結轉移的臨床分析[J];河南腫瘤學雜志;2004年06期

9 姚金光,鄺曉聰,溫冠媚,李俊;基質金屬蛋白酶-9表達與舌鱗癌浸潤轉移的關系[J];右江醫(yī)學;2005年05期

10 郝鳳翔;武云霞;;人舌鱗癌裸鼠移植瘤模型的建立[J];山西醫(yī)科大學學報;2008年03期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 葉華山;潘朝斌;黃洪章;李勁松;趙小朋;張彬;王建廣;楊朝暉;;127例舌鱗癌患者單純手術治療的生存和預后分析[A];第八次全國口腔頜面—頭頸腫瘤會議論文匯編[C];2009年

2 余東升;黃洪章;潘朝斌;劉習強;唐海闊;胡曉文;;放射誘導啟動子介導雙自殺基因治療人舌鱗癌裸鼠移植瘤的實驗研究[A];第五次全國口腔頜面—頭頸腫瘤學術研討會論文匯編[C];2006年

3 周何強;徐華;魏運輝;樂飛;;212例舌鱗癌的手術及綜合治療的療效分析[A];第四屆中國腫瘤學術大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術會議論文集[C];2006年

4 王帆;王學慶;劉良福;李尊民;;舌鱗癌術前超選擇舌動脈灌注化療栓塞的臨床應用[A];第八屆全國腫瘤介入診療學術大會、第一屆中國抗癌協(xié)會腫瘤介入學護理專業(yè)學組會議暨國家級介入診療繼續(xù)教育學習班、腫瘤介入治療新進展研討會論文匯編[C];2007年

5 劉天潤;楊安奎;陳福進;李秋梨;曾宗淵;陳艷峰;歐陽電;郭朱明;張詮;;229例晚期舌鱗癌患者的生存和預后分析[A];中華醫(yī)學會第十次全國耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議論文匯編（上）[C];2007年

6 潘朝斌;黃洪章;陳偉良;王建廣;李海剛;;腫瘤血管生成與舌鱗癌預后的相關性研究[A];第一屆全國口腔頜面部腫瘤學術會議論文匯編[C];2001年

7 盧利;王玉新;王兆元;;舌鱗癌淋巴細胞浸潤的觀察[A];中華口腔醫(yī)學會第二次全國會員代表大會暨第七次全國口腔醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2001年

8 曾宗淵;彭漢偉;陳福進;郭朱明;張詮;魏茂文;楊安奎;陳文寬;;舌鱗癌頸淋巴結治療模式的探討[A];第三屆中國腫瘤學術大會教育論文集[C];2004年

9 姚華;吳求亮;姚晨;范駿;;反義端粒酶逆轉錄酶基因寡核苷酸對人舌鱗癌細胞凋亡的影響[A];浙江省第二十次腫瘤防治學術年會暨首屆浙江腫瘤學術周論文匯編[C];2006年

10 王雷;陳英新;;乳鐵蛋白對舌鱗癌細胞血管內皮生長因子和堿性成纖維生長因子表達影響的實驗研究[A];第七屆全國口腔黏膜病暨第五屆口腔中西醫(yī)結合大會論文匯編[C];2008年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 向旭;舌鱗癌連續(xù)整塊切除術預后及其影響因素的臨床研究[D];中南大學;2010年

2 徐文華;白細胞介素-8在舌鱗癌中的表達及其與血管新生的相關性研究[D];安徽醫(yī)科大學;2006年

3 賈搏;舌鱗癌患者長鏈非編碼RNA分子鑒定及其表達譜分析研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

4 俞小玲;異硫氰酸芐基酯對人舌鱗癌細胞生長的影響[D];浙江大學;2011年

5 劉志剛;血管抑素下調人舌鱗癌細胞血管內皮生長因子的表達[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

6 蔣文;蛋白激酶C-δ在舌鱗癌中的表達特征及熱誘導舌鱗癌細胞凋亡中的作用[D];昆明醫(yī)學院;2009年

7 劉凱;不同溫度和時間對人舌鱗癌細胞凋亡影響的研究[D];佳木斯大學;2009年

8 李學敏;裸鼠人舌鱗癌頸淋巴結轉移模型癌灶及癌周淋巴管生成密度的觀察研究[D];天津醫(yī)科大學;2013年

9 劉亞莉;雌激素受體在人舌鱗狀細胞癌細胞中的表達及β-雌二醇對人舌鱗癌細胞增殖的影響[D];第四軍醫(yī)大學;2002年

10 董剛;異搏定增強長春新堿抗人舌鱗癌細胞作用的體外研究[D];南昌大學;2006年

，

本文編號：756745