本文關(guān)鍵詞：紫草素逆轉(zhuǎn)NSCLC的EGFR-TKI耐藥及靶向紫草素納米顆粒的初步制備

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【摘要】：目的:EGFR-TKI(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐藥,導致EGFR敏感突變患者治療失敗甚至死亡,嚴重影響了人類健康和生命,EGFR-TKI耐藥機制復(fù)雜,克服耐藥成為該領(lǐng)域研究的熱點和難點。為克服EGFR-TKI耐藥,本實驗擬觀察紫草素逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥NSCLC細胞株的作用及其可能機理;嘗試構(gòu)建EGFR單鏈抗體(簡稱scFv)介導的紫草素納米顆粒。方法:1、紫草素不同濃度作用EGFR-TKI耐藥肺腺癌H1975細胞(20號外顯子T790M突變以及21號外顯子L858R突變),MTT實驗觀察紫草素作用24 h、48 h和72 h對肺腺癌細胞增殖的影響,相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和周期,Western blot檢測細胞中EGFR信號通路下游關(guān)鍵分子EGFR、AKT、ERK表達及磷酸化水平,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2表達以及DNA修復(fù)酶PARP的變化。2、低濃度(1.25μM)紫草素聯(lián)合一代EGFR-TKI(吉非替尼/鹽酸�？颂婺�)共同作用于EGFR繼發(fā)耐藥細胞株,通過MTT法、克隆形成實驗、流式細胞術(shù)和Western blot法觀察細胞增殖、凋亡以及EGFR、AKT、ERK表達及磷酸化水平。3、采用單乳化容劑蒸發(fā)法合成高分子聚合物PLGA-PEG負載的紫草素和超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SIONPs),之后與單鏈抗體偶聯(lián);通過透射電鏡、激光粒度儀、免疫熒光鏡檢測載藥納米顆粒形態(tài)、粒徑、電荷以及細胞內(nèi)化情況。結(jié)果:1、紫草素能夠抑制H1975細胞增殖,該抑制作用呈濃度和時間依賴性,紫草素濃度為10μM時,耐藥細胞抑制率達到70%;流式細胞術(shù)顯示紫草素誘導H1975細胞發(fā)生凋亡,紫草素濃度為10μM時,凋亡率達到70%;細胞周期分析發(fā)現(xiàn)紫草素阻滯細胞于S期,EGFR、AKT和ERK蛋白表達下降,p-EGFR、p-AKT和p-ERK磷酸化水平降低,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達減少,PARP發(fā)生剪切。2、紫草素聯(lián)合EGFR-TKI,增加細胞抑制,促使細胞死亡;EGFR、AKT和ERK蛋白表達無明顯變化,但是p-EGFR、p-AKT和p-ERK磷酸化水平卻降低。3、構(gòu)建的抗EGFR單鏈抗體-紫草素納米顆粒(scFv-SHK-SIONPs),表觀特征分析顯示納米顆粒呈球形,多分散指數(shù)(PI)為0.058,粒度大小均一,粒徑為173.3 nM,Zeta電荷-28.55 mV,熒光顯微鏡下顯示H1975細胞內(nèi)高效攝取scFv-SHK-SIONPs。結(jié)論:1、紫草素能夠抑制EGFR-TKI耐藥肺癌細胞株增殖,誘導其凋亡,機制可能與下調(diào)EGFR、AKT和ERK的表達及其磷酸化水平有關(guān),與降低凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達和促使PARP發(fā)生剪切有關(guān)。2、紫草素恢復(fù)了肺腺癌耐藥細胞株對EGFR-TKI的敏感性。3、成功構(gòu)建scFv-SHK-SIONPs,表征分析符合實驗要求,腫瘤細胞能夠主動攝取scFv-SHK-SIONPs進入胞內(nèi)。
【關(guān)鍵詞】：非小細胞肺癌 EGFR-TKI耐藥 靶向治療 紫草素 納米藥物載體
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-12
• 文獻回顧12-20
• 第一部分 紫草素對EGFR-TKI耐藥NSCLC作用的實驗研究20-30
• 1 材料20-22
• 2 方法22-26
• 3 結(jié)果26-29
• 4 討論29-30
• 第二部分 紫草素逆轉(zhuǎn)NSCLC的EGFR-TKI耐藥的實驗研究30-43
• 1 材料30-32
• 2 方法32-35
• 3 結(jié)果35-41
• 4 討論41-43
• 第三部分 抗EGFR單鏈抗體紫草素納米顆粒的初步構(gòu)建43-50
• 1 材料43-44
• 2 方法44-46
• 3 結(jié)果46-47
• 4 討論47-50
• 小結(jié)50-51
• 參考文獻51-58
• 個人簡歷和研究成果58-59
• 致謝59

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本文編號：752526