本文關鍵詞：ART1對uPA基因啟動子甲基化影響在小鼠結腸癌CT26細胞侵襲轉移中的作用

  更多相關文章： 精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉移酶-1 DNA甲基轉移酶1 DNA甲基化 侵襲 轉移

【摘要】：目的：探究精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉移酶-1(Arginine-specific mono-ADP-ribosytransferases-1, ART1)對uPA基因啟動子甲基化的影響及其在小鼠結腸癌CT26細胞侵襲轉移中的作用。方法：本實驗以CT26細胞ART1高表達組(GFP-ART1)、ART1沉默組(GFP-shARTl)為實驗組,CT26細胞空載體組(GFP-Vector組)、未轉染組(Un-transfection組)為對照組,western blot測定不同組別DNA甲基轉移酶1(DNMT1)表達變化,同時,ART1高表達組、ART1沉默組、空載體組及未轉染組CT26細胞分別接種于BALB/C小鼠,構建各組別BALB/C小鼠脾臟移植瘤模型并提取各組移植瘤組織蛋白,Western blot測定不同組別DNA甲基轉移酶1(DNMT1)表達變化。DNA甲基化特異性PCR測序法檢測不同組別uPA基因啟動子甲基化狀態(tài)變化；免疫共沉淀方法觀察CT26細胞ART1高表達組、空載體組及未轉染組ART1與DNMT1之間的關系。應用DNA甲基轉移酶抑制劑5-雜氮-2-脫氧胞苷(5-aza-2-dc)處理ART1沉默組CT26細胞,劃痕實驗和Transwell侵襲實驗觀察細胞遷移及侵襲能力的變化。BALB/C小鼠脾臟接種ART1基因沉默CT26細胞,腹腔注射5-aza-2-dc,與對照組比較小鼠脾臟移植瘤細胞肝轉移情況。采用western blot檢測GFP-shARTl、GFP-ART1、Un-transfection及GFP-Vector各組腫瘤細胞uPA表達變化,同時檢測各組細胞脾臟移植瘤uPA表達變化,并應用DNA甲基轉移酶抑制劑5-aza-2-dc處理ART1沉默組CT26細胞,western blot方法檢測其uPA表達變化,同時檢測5-aza-2-dc處理沉默組與未處理沉默組脾臟移植瘤uPA表達變化。結果：(1)ARTl對小鼠結腸癌CT26細胞uPA基因啟動子甲基化水平的影響：western blot方法檢測ART1高表達組、ART1沉默組、未轉染組、空載體組CT26細胞DNMT1表達變化,結果顯示,與對照組相比,ART1高表達組DNMT1表達減少,而ART1沉默組DNMT1表達增加(P0.01)；同時檢測各組小鼠脾臟移植瘤蛋白中DNMT1表達變化,結果顯示同樣的趨勢(P0.01)；采用DNA甲基化特異性PCR測序方法測定uPA啟動子甲基化水平在各組的變化,結果顯示與對照組相比,ART1高表達組uPA基因啟動子甲基化水平降低,而ART1沉默組uPA基因啟動子甲基化水平升高。免疫共沉淀結果顯示ART1與DNMT1之間尚未發(fā)生直接的結合。(2)ARTl通過對uPA基因啟動子甲基化狀態(tài)的影響導致其表達變化及其在小鼠結腸癌CT26細胞侵襲、轉移能力的作用：細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測5-aza-2-dc處理組和未處理組CT26沉默細胞遷移及侵襲能力,結果顯示與未處理組相比,5-aza-2-dc處理組細胞24h遷移距離明顯增高(P0.01),且降解Matrigel基質膠穿過小室的細胞數(shù)明顯升高(P0.01)。采用5-aza-dc處理沉默組CT26細胞構建小鼠脾臟移植瘤模型,觀察小鼠肝轉移情況,結果顯示與未處理組相比,處理組小鼠肝轉移模型的肝臟轉移結節(jié)數(shù)(P0.05)和肝臟重量顯著增加(P0.05)。采用western blot方法檢測ARTl高表達組,ART1沉默組,未轉染組,空載體組CT26細胞uPA表達變化,結果顯示與對照組相比,GFP-ART1組uPA表達增加,而GFP-shART1組uPA表達減少(P0.01)；同時檢測各組小鼠脾臟移植瘤蛋白中uPA表達變化,結果顯示同樣的趨勢(P0.01)；采用5-aza-2-dc處理沉默組細胞后,顯示uPA表達增加(P0.01)；同時western blot方法檢測5-aza-2-dc處理組與未處理組CT26沉默細胞移植瘤蛋白結果顯示,與未處理組相比,uPA表達顯著增加(P0.01)。結論：ART1沉默能夠促進DNMT1表達,促進侵襲轉移相關基因uPA啟動子高甲基化,引起uPA蛋白表達減少,相反ART1高表達,則使DNMT1表達降低,uPA啟動子甲基化程度降低,其蛋白表達增加,同時,抑制DNMT1, uPA基因蛋白表達增加,CT26細胞侵襲、轉移能力增強,提示ARTl可通過抑制uPA基因啟動子甲基化,而促進其表達,從而在小鼠結腸癌CT26細胞侵襲轉移中發(fā)揮促進作用。其詳細的機制仍有待深入探究。
【關鍵詞】：精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉移酶-1 DNA甲基轉移酶1 DNA甲基化 侵襲 轉移
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 ART1對UPA基因啟動子甲基化的影響15-25
• 1 實驗材料15-16
• 2 實驗方法16-21
• 3 實驗結果21-22
• 4 討論22-25
• 第二部分 ART1對UPA基因啟動子甲基化影響在小鼠結腸癌CT26細胞侵襲轉移中的作用25-35
• 1 實驗材料25-26
• 2 實驗方法26-28
• 3 實驗結果28-33
• 4 討論33-35
• 全文總結35-37
• 參考文獻37-41
• 附圖41-42
• 文獻綜述42-48
• 參考文獻45-48
• 致謝48-49
• 碩士期間發(fā)表論文情況49

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8 李U，

本文編號：716712