本文關(guān)鍵詞：細(xì)絲蛋白A下調(diào)對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：目的:乳腺癌在女性腫瘤中引起的發(fā)病率及死亡率最高,嚴(yán)重危害女性健康。乳腺癌是一種全身性疾病,其中HER2陽性乳腺癌是指免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測HER2(human epidermal growth factor receptor-2)+++,或原位雜交(in situ hybridization,ISH)檢測為陽性的乳腺癌。20%~30%的乳腺癌中存在HER2過表達(dá),HER2陽性乳腺癌的惡性程度高,易出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后差。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),HER2陽性乳腺癌同樣作為一種異質(zhì)性群體存在。根據(jù)2013版乳腺癌的分子分型,大部分HER2陽性乳腺癌為HER2陽性型(非Luminal型),一小部分屬于Luminal B型中的Luminal B-like(HER2陽性)型,預(yù)后較差。對于HER2陽性乳腺癌常規(guī)予以抗HER2治療,但有效率不高。如何提高HER2陽性乳腺癌的治療效果,尋找更加有效的治療措施,已成為乳腺癌治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。因此,進(jìn)一步探索HER2陽性乳腺癌的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的乳腺癌治療方法勢在必行。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族,它的成員包括:ErbB-1/EGFR、ErbB-2/HER2、ErbB-3/HER3和ErbB-4/HER4,與乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。表皮生長因子受體通過與配體(如EGF)結(jié)合形成同源或異源二聚體,進(jìn)而激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如MAPK/ERK、PI3K/Akt等,最終促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成。至今仍未發(fā)現(xiàn)HER2有明確的配體,但它可與EGFR家族中其他成員形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。HER2在多種組織中均有表達(dá),如乳腺、胃、結(jié)直腸等,生理情況下調(diào)控著組織內(nèi)細(xì)胞的增殖和分化,而異�；罨瘎t會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究報(bào)道,HER2過表達(dá)是乳腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。因此,HER2成為了一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。目前針對HER2的分子靶向藥物如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等已應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療,但其單獨(dú)應(yīng)用的有效率不高且存在耐藥問題,提示在HER2過表達(dá)的乳腺癌中仍有未知的信號分子調(diào)節(jié)HER2信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),對乳腺癌的發(fā)生具有重要影響。細(xì)絲蛋白A(Filamin A,FLNa)又稱肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白280(actin-binding protein 280,ABP-280),分子量280k Da,由Stossel等首次發(fā)現(xiàn)于非肌肉組織的肌動(dòng)蛋白細(xì)絲交聯(lián)蛋白中。全長的FLNa主要定位于細(xì)胞質(zhì),容易發(fā)生蛋白分解。其90k Da的裂解片段可以定位于細(xì)胞核。FLNa是“V”形的同型二聚體,由肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)、24個(gè)重復(fù)的β-折疊片層和2個(gè)絞鏈區(qū)組成。FLNa的特殊結(jié)構(gòu)決定其具有強(qiáng)大的功能:FLNa分子可交聯(lián)肌動(dòng)蛋白絲形成穩(wěn)定的細(xì)胞骨架,并與多種細(xì)胞膜蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。Zhu等認(rèn)為FLNa可以調(diào)控人惡性黑色素瘤細(xì)胞EGFR的活化,EGFR與HER2屬同一家族,而FLNa能否參與HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的活化目前并無相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過:(1)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立下調(diào)FLNa的HER2陽性乳腺癌MDA-MB-453穩(wěn)定細(xì)胞株;(2)采用MTS法、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、Transwell法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力;(3)采用Western blot法,檢測HER2及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各激酶的活化水平。意在從細(xì)胞、分子水平探討FLNa對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453增殖、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)機(jī)制,研究FLNa下調(diào)對HER2活化及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,為更精準(zhǔn)地治療HER2陽性乳腺癌提供有效的靶點(diǎn)。方法:1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建下調(diào)FLNa的穩(wěn)定細(xì)胞株將FLNa sh RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453中,經(jīng)嘌呤霉素篩選,獲得下調(diào)FLNa的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(MDA-MB-453/KD)及其對照組細(xì)胞株(MDA-MB-453/Ctrl);利用Western blot檢測其中FLNa的蛋白水平。2 MTS法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖能力將MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞消化后各自接種到96孔板中,饑餓培養(yǎng)4h后,予不同濃度EGF(0n M、4n M、20n M、100n M)分別刺激培養(yǎng)48h,加入MTS,酶標(biāo)儀上檢測各孔的OD值。通過比較各組之間的差別來測定細(xì)胞的增殖情況。3通過劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)來檢測MDA-MB-453細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后的遷移情況將MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞各自接種于24孔板,饑餓培養(yǎng)4h后,用10ul槍頭在底部劃痕。兩組細(xì)胞均分為無EGF刺激組和20n M EGF刺激組;置于顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)情況,定時(shí)進(jìn)行拍照,直至劃痕愈合。4 Transwell實(shí)驗(yàn)測定MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的侵襲情況將基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室,MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl兩組細(xì)胞消化后分別鋪于小室上室,在無FBS的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),下室放入含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液中,培養(yǎng)6天后;取出小室,用95%冰乙醇固定、HE染色,顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。5 Western blot檢測HER2活化水平及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的變化將MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿,無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓4h,經(jīng)20n M EGF刺激后,于不同時(shí)間(0min、5min、10min、30min)收集細(xì)胞,提取總蛋白;采用Western blot檢測FLNa、p-HER2、HER2、p-Akt、Akt、p-ERK及ERK的水平,以b-actin作為內(nèi)參蛋白。結(jié)果:1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中FLNa蛋白表達(dá)水平的檢測采用Western blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中FLNa蛋白的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下,MDA-MB-453/KD細(xì)胞FLNa的相對表達(dá)量(0.60±0.05)明顯少于MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞(1.05±0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。2檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力2.1MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖能力采用MTS法檢測MDA-MB-453細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)后的增殖情況:各濃度EGF(0n M、4n M、20n M、100n M)刺激的MDA-MB-453/KD組細(xì)胞的OD值(1.26±0.03,1.39±0.01,1.55±0.02,1.82±0.04)明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(0.88±0.02,0.98±0.03,1.07±0.14,1.38±0.09),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。2.2MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的遷移能力采用Wound healing實(shí)驗(yàn)測定MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)株的遷移情況:無EGF刺激時(shí),MDA-MB-453/KD細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的遷移率(23.06±0.14%,23.26±0.14%,39.62±0.04%,47.16±0.16%)均明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(7.85±1.08%,7.85±1.87%,12.15±0.53%,20.93±1.39%),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);給予20n M EGF刺激時(shí),MDA-MB-453/KD組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的遷移率(30.16±0.62%,36.59±0.77%,42.87±1.53%,50.00±0.00%)亦明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(13.34±0.51%,14.38±1.18%,15.80±1.56%,25.65±0.43%),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。2.3 MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的侵襲能力采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)株的侵襲情況:MDA-MB-453/KD組平均穿膜細(xì)胞數(shù)(3±0.23)明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(14±0.44),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。3 MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HER-2活化水平及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的變化采用Western blot實(shí)驗(yàn)測定MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞在20n M EGF刺激0min、5min、10min、30min后各蛋白的表達(dá)水平:MDA-MB-453/KD組FLNa的表達(dá)量(0.22±0.02,0.25±0.03,0.22±0.02,0.23±0.04)均明顯低于MDA-MB-453/Ctrl組(0.82±0.03,0.83±0.03,0.82±0.03,0.84±0.03),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);經(jīng)EGF刺激5min、10min、30min后p-HER2的水平(0.83±0.02,0.71±0.05,0.59±0.03)均明顯高于Ctrl組(0.42±0.05,0.17±0.01,0.07±0.03),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);p-Akt的水平(0.84±0.05,0.63±0.04,0.46±0.03)均明顯高于Ctrl組(0.44±0.03,0.24±0.03,0.06±0.02),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);p-ERK的水平(0.83±0.02,0.86±0.02,0.79±0.02)均明顯高于Ctrl組(0.44±0.04,0.27±0.04,0.17±0.03),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。結(jié)論:1下調(diào)FLNa的表達(dá)水平可促進(jìn)HER2陽性乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。2 FLNa通過調(diào)控HER2陽性乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞HER2的活化即磷酸化水平,調(diào)節(jié)MAPK/ERK及PI3K/Akt信號通路中激酶的活化,最終影響MDA-MB-453細(xì)胞的生物學(xué)行為。
【關(guān)鍵詞】：HER2陽性乳腺癌 細(xì)絲蛋白A 表皮生長因子 生物學(xué)行為 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-31
• 結(jié)果31-33
• 附圖33-40
• 附表40-43
• 討論43-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 綜述 HER2陽性乳腺癌分子靶向治療的研究進(jìn)展53-66
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡歷67

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本文編號：716588