本文關鍵詞：TC-1介導TRE17癌基因誘導的人MCF-7乳腺癌細胞遷移

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【摘要】：[研究目的]TRE17(也稱為TRE2或USP6)癌基因最早發(fā)現(xiàn)于人Ewing肉瘤,高表達于平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤和乳腺癌等,能使正常成纖維細胞NIH 3T3發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。然而,TRE17的致瘤機制和對腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響尚未清楚。甲狀腺癌基因-1(TC-1,又名C8orf4),高表達于胃癌,肺癌,乳腺癌和結(jié)腸癌并且可以使正常甲狀腺細胞惡性轉(zhuǎn)化。TC-1能和Chibby競爭性結(jié)合(3-catenin,從而使Chibby對β-catenin蛋白的拮抗作用減弱,進而上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因,如MMP、VEGF、 TCF,這些靶基因均已被證實與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖等行為密切相關。我們的前期基因芯片結(jié)果提示TRE17高表達可上調(diào)人乳腺癌MCF-7細胞中TC-1水平。因此,本實驗主要探討TRE17通過TC-1上調(diào)Wnt/β-catenin信號促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移的分子機制,以進一步闡釋癌基因TRE17在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。[研究方法]1.為了研究TRE17高表達對乳腺癌MCF-7細胞遷移的影響,我們將Flag-TRE17和空載體Flag-pcDNA3.0質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MCF-7和HEK293細胞,應用Transwell遷移實驗和劃痕實驗分析TRE17高表達對細胞遷移能力的影響。2.為了探討TRE17影響細胞遷移能力的機制,我們采用基因芯片技術(shù)篩選TRE17高表達的差異表達基因。以Flag空載體為對照,用癌基因TRE17轉(zhuǎn)染人MCF7乳腺癌細胞,對照和實驗各送2例進行基因芯片檢測,基因芯片結(jié)果提示,TRE17轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞中差異表達基因上調(diào)的多達404種,本實驗室對上調(diào)倍數(shù)較高的基因進行驗證實驗,其中,用RealTime-PCR和WesternBlot方法觀察了TRE17癌基因高表達對MCF-7細胞TC-1mRNA和蛋白水平的影響。TRE17是由USP32和TBC1D3融合而成。為了進一步明確TRE17各結(jié)構(gòu)域在其調(diào)節(jié)MCF-7細胞TC-1表達中的作用,我們用TBC結(jié)構(gòu)域部分缺失突變體Flag-TRE17 (△59-116)、Flag-TRE17 (△117-174)和鈣調(diào)蛋白(Camodulin, CaM)結(jié)合位點突變體Flag-TRE17 (F328E)、USP結(jié)構(gòu)域中USP活性位點突變體Flag-TRE17(-USP)及Flag-TRE17分別轉(zhuǎn)染MCF-7細胞,用Western blot方法檢測細胞裂解物中TC-1蛋白水平。3.TC-1高表達能使人正常乳腺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞,但對乳腺癌細胞遷移性是否有影響還未見報道。為了觀察TC-1在乳腺癌MCF-7細胞遷移中的作用,我們構(gòu)建了TC-1真核表達質(zhì)粒：從MCF-7細胞中提取總RNA,通過RT-PCR擴增TC-1 cDNA全長開放讀碼框架(open reading frame, ORF),并插入真核表達載體Flag-pcDNA3.0中,構(gòu)建了TC-1真核表達質(zhì)粒Flag-TC-1/pcDNA3.0;將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人MCF-7細胞,進行Western blot分析,鑒定重組質(zhì)粒融合蛋白Flag-TC-1表達；將空載體和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MCF-7、BT549細胞,進行Trans well遷移實驗和劃痕實驗,分析TC-1高表達在乳腺癌遷移中的作用。4.為了明確TC-1在TRE17影響的MCF-7細胞遷移中的作用,我們構(gòu)建了靶向人TC-1基因不同部位的TC-1 shRNA慢病毒載體TC-1 (653) shRNA、 TC-1(1512) shRNA和TC-1(1566) shRNA及對照慢病毒載體NC shRNA,分別感染MCF-7細胞系,用Western blot檢測TC-1蛋白表達水平,明確TC-1特異性shRNA的有效性；隨后,以Flag空載體為對照,用Flag-TRE17分別轉(zhuǎn)染NC shRNA或TC-1 (1566) shRNA感染的MCF-7細胞,進行Trans well遷移實驗。已有研究表明TC-1癌蛋白能增強Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因(包括細胞遷移相關基因)轉(zhuǎn)錄。為了探討Wnt/β-catenin信號通路在TRE17影響MCF-7細胞遷移中的作用,我們用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV-939處理MCF-7,并進行Transwell遷移實驗。[研究結(jié)果]1. 為探討TRE17癌基因表達對細胞遷移的影響,我們進行了Transwell小室細胞遷移實驗。結(jié)果顯示,用Flag-TRE17轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞遷移數(shù)顯著多于用Flag空載體轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞遷移數(shù)；與此相似,TRE17高表達的HEK293細胞遷移能力也明顯強于對照組HEK293-Flag。細胞劃痕實驗結(jié)果同樣顯示,高表達TRE17的MCF-7細胞遷移能力明顯增強。這些結(jié)果表明,TRE17高表達促進細胞遷移。2. 為了深入研究TRE17促進細胞遷移的分子機制,我們用基因芯片技術(shù)篩選了TRE17在MCF-7細胞中高表達的差異表達基因,發(fā)現(xiàn)TRE17轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞中差異表達基因多達404種。在用FLAG-pcDNA3.0空載質(zhì)粒和FLAG-TRE17-pcDNA3.0重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MCF-7細胞,提取細胞總RNA后,用Real-Time RT-PCR方法對某些差異表達基因進行了驗證實驗,其中,高表達TRE17的人MCF7乳腺癌細胞中TC-1 mRNA表達增加2倍以上。用Western blot方法進行研究的結(jié)果顯示,Flag轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞中內(nèi)源性TC-1蛋白水平較低,而用TRE17轉(zhuǎn)染的細胞中TC-1蛋白表達顯著增加。這些結(jié)果表明,TRE17高表達能促進MCF-7細胞中TC-1基因mRNA和蛋白表達。用TBC結(jié)構(gòu)域部分缺失突變體Flag-TRE17 (△59-116)、Flag-TRE17 (△117-174)和鈣調(diào)蛋白(Camodulin, CaM)結(jié)合位點突變體Flag-TRE17 (F328E)、 USP結(jié)構(gòu)域中USP活性位點突變體Flag-TRE17(-USP)及Flag-TRE17和空載體Flag-pcDNA3.0進行研究的結(jié)果顯示,與空載體對照相比,Flag-TRE17及突變體Flag-TRE17 (F328E)和Flag-TRE17(-USP)高表達均能增加MCF-7細胞中TC-1蛋白水平,但TBC結(jié)構(gòu)域部分缺失突變體Flag-TRE17 (△59-116)和Flag-TRE17 (△117-174)喪失了促進TC-1蛋白表達的作用。這些結(jié)果提示,TRE17促進MCF-7細胞TC-1表達的作用依賴于其TBC結(jié)構(gòu)域,但不依賴于USP結(jié)構(gòu)域,而CaM結(jié)合與否并不影響TRE17刺激TC-1表達的作用。3. 為了探討TC-1高表達對乳腺癌MCF-7細胞遷移的影響,我們用RT-PCR方法克隆了的人TC-1 cDNA完整ORF,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)1條337bp左右的DNA條帶,大小與預期相符。回收的該RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳和回收純化后,與經(jīng)同樣雙酶切的真核表達載體Flag-pcDNA3.0質(zhì)粒連接,生成重組質(zhì)粒Flag-TC-1-pcDNA3.0。該質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切時出現(xiàn)327 bp特征性片段；DNA序列測定證實序列無誤。隨后,用Flag-pcDNA3.0空載體和Flag-TC-1-pcDNA3.0重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人MCF-7乳腺癌細胞,進行Transwell遷移實驗,結(jié)果顯示TC-1高表達的MCF-7細胞遷移能力明顯強于對照組MCF-7-Flag。與此相似,用人BT549乳腺癌細胞進行劃痕實驗的結(jié)果顯示,在劃痕后12小時,空載體轉(zhuǎn)染的BT549細胞的劃痕大小幾乎無明顯變化,而TC-1轉(zhuǎn)染細胞的劃痕已縮小近50%；在24小時后,空載體對照細胞的劃痕大小僅縮小不到三分之一,而高表達TC-1的BT549癌細胞的劃痕已接近消失。這些結(jié)果表明,TC-1高表達能增強人乳腺癌細胞的遷移性。4.為了明確TC-1在TRE17誘導的MCF-7細胞遷移中的作用,我們以Flag空載體為對照,用Flag-TRE17分別轉(zhuǎn)染NC shRNA對照或特異性抑制TC-1表達的shRNA慢病毒載體TC-1 (1566) shRNA感染的MCF-7細胞,進行Transwell遷移實驗。結(jié)果顯示,在細胞內(nèi)TC-1蛋白水平未被敲低時,TRE17癌蛋白高表達顯著增加MCF-7細胞遷移；而用RNA干擾技術(shù)敲低TC-1后,既能抑制TRE17未高表達的MCF-7細胞遷移,也能抑制TRE17高表達誘導的MCF-7遷移,各組之間有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。這些結(jié)果提示,TC-1癌蛋白調(diào)節(jié)人MCF-7乳腺癌細胞遷移,并且至少部分介導TRE17癌蛋白誘導的MCF-7細胞遷移。用Wnt/p-catenin信號通路抑制劑XAV-939處理MCF-7的Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,TRE17和TC-1癌蛋白分別高表達均能促進MCF-7細胞遷移,而加入藥物XAV-939抑制Wnt/β-catenin信號通路后,不僅轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7細胞遷移明顯減弱,而且TRE17和TC-1促進MCF-7細胞遷移的作用也喪失(P0.05)。這些結(jié)果提示,TRE17可能通過TC-1/Wnt/β-catenin信號通路促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移。[結(jié)論]1 TRE17高表達能促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移；2在人MCF-7細胞中,TRE17癌基因依賴TBC域促進TC-1蛋白水平上調(diào)；3TRE17可能部分通過調(diào)節(jié)TC-1的表達促進人MCF-7細胞的遷移；4TRE17可能通過調(diào)節(jié)TC-1下游的Wnt-β-catenin信號通路促進MCF-7細胞的遷移。
【關鍵詞】：癌基因 TRE17 遷移 甲狀腺癌基因TC-1 Wnt-β-catenin信號通路
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-17
• 縮略語17-19
• 前言19-21
• 文獻綜述 TC-1在乳腺癌細胞中wnt/信號轉(zhuǎn)導的作用機制研究21-26
• 第一章 癌蛋白TRE17高表達促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移26-36
• 1 實驗材料26-29
• 2 實驗方法29-33
• 3 結(jié)果33-36
• 第二章 癌蛋白TRE17高表達促進人MCF-7乳腺癌細胞中TC-1癌基因上調(diào)36-43
• 1 實驗材料36-37
• 2 試驗方法37-40
• 3 結(jié)果40-43
• 第三章 癌蛋白TC-1高表達促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移43-54
• 1 實驗材料43-44
• 2 實驗方法44-50
• 3 實驗結(jié)果50-54
• 第四章 敲低TC-1抑制TRE17誘導的人MCF-7乳腺癌細胞遷移54-58
• 1 實驗材料54
• 2 試驗方法54-55
• 3 實驗結(jié)果55-58
• 討論58-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻61-64
• 致謝64-65
• 作者簡介65-66
• 附件66-67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫曉楠;郭衛(wèi)東;張惠潔;;TC-1在Wnt/β-catenin信號通路中的研究進展[J];中國冶金工業(yè)醫(yī)學雜志;2014年01期

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本文編號：710683