本文關鍵詞：工程化CTL凝膠預防直腸癌術后復發(fā)研究

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【摘要】：研究背景目前,直腸癌已成為全世界范圍內(nèi)最為常見的一種惡性腫瘤,在中國的發(fā)病率近年來也迅速增長,成為城市發(fā)病率第一的惡性腫瘤。直腸癌手術治療是對其根治的最有效方法,然而對部分低位直腸癌的手術卻陷入兩難境地,對于生活質(zhì)量要求較高的患者,腹會陰聯(lián)合根治術造成身體、心理創(chuàng)傷往往難以接受,而保肛手術存在根治不徹底、腫瘤復發(fā)率高的風險,術后常規(guī)的放、化療又存在副作用大、術區(qū)粘連的弊端。我們希望能夠找到一種術中應用的輔助治療手段,在局部切除的同時,能夠降低腫瘤的復發(fā),消滅殘存的惡性腫瘤細胞,同時還能減少放療所帶來的副作用。目前,過繼細胞免疫治療已成為治療惡性腫瘤的第四種療法,在臨床得到廣泛應用,也越來越凸顯出其良好療效,在綜合治療惡性腫瘤疾病中顯現(xiàn)出巨大作用。該方法在提高患者自身免疫防御力及殺傷力的同時,積極消滅術后及放化療后血液、組織內(nèi)殘留的惡性腫瘤細胞,以實現(xiàn)降低惡性腫瘤復發(fā)率、延長生存期的目標,有著副作用小、特異性強的優(yōu)點。在體外培養(yǎng)的細胞毒性T淋巴細胞,具備靶向殺傷腫瘤細胞特點,有效控制腫瘤生長、復發(fā)及轉(zhuǎn)移。國內(nèi)外對于CTL細胞連續(xù)殺傷靶細胞的高效特點、抗原特異性特點、自身MHC限制性特點有很多研究,在多項臨床試驗中有穩(wěn)定的抗腫瘤效果,靜脈回輸CTL細胞在臨床也有實際應用。而將CTL細胞與含有大量水分利于營養(yǎng)物質(zhì)運輸及免疫活性細胞遷移、具有網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的凝膠材料結(jié)合構(gòu)建類淋巴組織卻在國際上沒有報道,本實驗室前期研究證實透明質(zhì)酸鈉與免疫活性細胞結(jié)合能夠最大限度保持其活性并發(fā)揮最大殺傷能力。故本實驗擬應用CTL細胞結(jié)合透明質(zhì)酸鈉凝膠構(gòu)建工程化類淋巴組織,以觀察其預防裸鼠直腸癌術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的療效。研究目的建立裸鼠直腸癌局部切除模型,通過制備CTL透明質(zhì)酸鈉凝膠構(gòu)建的工程化類淋巴組織,對CTL凝膠預防裸鼠直腸癌切除后復發(fā)情況進行分析,為CTL凝膠的臨床應用奠定基礎。研究方法：1、利用人結(jié)腸癌sw480細胞系建立裸鼠低位直腸癌模型,一周后利用外科能量平臺進行切除,構(gòu)建裸鼠低位直腸癌切除模型；2、提取健康人血液,密度梯度離心分離PBMCs,制備載荷sw480抗原的DC細胞及T細胞,兩周后收獲CTL細胞；3、稀釋透明質(zhì)酸鈉凝膠,取CTL細胞1.8×10。,制備CTL凝膠待局部注射,將另一部分CTL細胞與無血清培養(yǎng)基混合,使細胞數(shù)達到6×107待尾靜脈注射；4、實驗組手術部位周圍局部注射CTL凝膠,其中一組注射凝膠同時尾靜脈注射CTL溶液；5、觀察腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移情況,每日記錄腫瘤生長變化情況,兩周后處死全部裸鼠,術區(qū)拍照對比,腫瘤、肝、脾、腫大淋巴結(jié)稱重,血液行血常規(guī)檢查,血液及研磨后脾臟行流式細胞儀檢測,腫瘤及周圍組織標本送病理檢查、免疫組化檢查。6、統(tǒng)計分析效果評價。研究結(jié)果1、成功構(gòu)建出裸鼠低位直腸癌模型及裸鼠低位直腸癌切除模型；2、手術切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組抑瘤率為89.45%,手術切除+CTL凝膠組82.21%,與其他三組比較差異顯著；3、手術切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組腫瘤重量與手術切除+CTL凝膠組比較有差異(P0.05),與手術切除組、凝膠組及對照組相比差異顯著(P0.01)；4、手術切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組淋巴細胞比例、血液中T細胞比例、脾指數(shù)均與其他三組差異顯著(P0.01)；5、手術切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組及手術切除+CTL凝膠組復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率與手術切除組、凝膠組及對照組相比差異顯著；6、病理結(jié)果提示手術切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組及手術切除+CTL凝膠組腫瘤切除原位無復發(fā),無腫瘤組織殘留,免疫組化檢查顯示其腫瘤切除部位周圍有大量T細胞浸潤,單純凝膠組腫瘤周圍大量T細胞浸潤。研究結(jié)論1、本研究制備的裸鼠直腸癌模型及裸鼠直腸癌局部切除模型符合直腸癌病理特點,制瘤率高,模擬了手術切除的過程及術后病理生理學特點,具備了直腸癌局部切除的特征,具有操作性強、方法簡便、可控性高的特點,對研究直腸癌手術及輔助治療具有較高的應用價值；2、CTL凝膠能夠有效抑制裸鼠直腸癌切除術后腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及種植,能夠提升T淋巴細胞數(shù)量、增強機體免疫能力,有效殺傷腫瘤細胞,減輕炎癥反應,減緩疾病進展；3、CTL凝膠聯(lián)合手術及靜脈輸注CTL細胞對與直腸癌術后有良好療效,減少術后粘連,有效殺傷殘留腫瘤細胞,增強了CTL持續(xù)抗瘤效果,改善免疫環(huán)境,增強了單獨手術及單獨免疫過繼治療的效果,可以作為直腸癌手術輔助治療手段。
【關鍵詞】：細胞毒T淋巴細胞 透明質(zhì)酸鈉凝膠 直腸癌術后
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.37
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-20
• 參考文獻17-20
• 第一章 裸鼠直腸癌切除模型建立20-29
• 第一節(jié) 實驗材料20-22
• 1.1.1 實驗動物及細胞株20
• 1.1.1.1 實驗動物20
• 1.1.1.2 細胞株20
• 1.1.2 主要試劑20-21
• 1.1.3 主要儀器21-22
• 1.1.4 試劑配置22
• 第二節(jié) 實驗方法22-24
• 1.2.1 人結(jié)直腸sw480腫瘤細胞復蘇以及培養(yǎng)22-23
• 1.2.2 裸鼠直腸癌動物模型建立23
• 1.2.3 裸鼠直腸癌切除模型建立23-24
• 1.2.4 統(tǒng)計學分析24
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果24-26
• 1.3.1 裸鼠直腸癌模型建造情況24-25
• 1.3.2 裸鼠直腸癌局部切除模型建立情況25-26
• 第四節(jié) 討論26-29
• 第二章 工程化CTL凝膠制備29-36
• 第一節(jié) 實驗材料29-31
• 2.1.1 研究對象29
• 2.1.2 主要試劑29-30
• 2.1.3 主要實驗儀器30-31
• 2.1.4 主要試劑配制方法31
• 第二節(jié) 實驗方法31-33
• 2.2.1 密度梯度離心分離PBMCs31-32
• 2.2.2 DC細胞培養(yǎng)32
• 2.2.3 CTL細胞培養(yǎng)32
• 2.2.4 透明質(zhì)酸鈉凝膠制備32-33
• 2.2.5 工程化CTL凝膠制備33
• 第三節(jié) 結(jié)果33-35
• 2.3.1 CTL細胞培養(yǎng)結(jié)果33
• 2.3.2 CTL細胞流式檢測結(jié)果33-34
• 2.3.3 光鏡下工程化CTL凝膠中CTL細胞生長情況34-35
• 第四節(jié) 討論35-36
• 第三章 工程化CTL凝膠預防直腸癌局部切除術后復發(fā)的實驗研究36-56
• 第一節(jié) 實驗材料36-39
• 3.1.1 實驗動物及細胞株36-37
• 3.1.2 主要試劑37-38
• 3.1.3 主要儀器38-39
• 第二節(jié) 實驗方法39-43
• 3.2.1 CTL細胞培養(yǎng)及取用39
• 3.2.2 裸鼠直腸癌模型建立39
• 3.2.3 各組治療干預方法39-41
• 3.2.4 觀察各組裸鼠狀態(tài)及腫瘤生長情況41
• 3.2.5 裸鼠眼球取血、測血常規(guī)41
• 3.2.6 觀察腫瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移情況,淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移情況41
• 3.2.7 測定脾指數(shù)、脾臟淋巴細胞提取41-42
• 3.2.8 測量外周血、脾臟免疫細胞含量42
• 3.2.9 組織病理學檢查42
• 3.2.10 計算抑瘤率42-43
• 3.2.11 統(tǒng)計學分析43
• 第三節(jié) 結(jié)果43-53
• 3.3.1 各組裸鼠腫瘤生長情況43-44
• 3.3.2 腫瘤重量44-45
• 3.3.4 各組抑瘤率比較45
• 3.3.5 各組脾指數(shù)比較45-46
• 3.3.6 復發(fā)與轉(zhuǎn)移情況46-48
• 3.3.7 病理HE染色切片情況48-49
• 3.3.8 免疫組化檢查49-50
• 3.3.9 血液結(jié)果50-51
• 3.3.10 各組裸鼠外周血及脾臟免疫細胞含量比較51-53
• 第四節(jié) 討論53-56
• 第四章 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-62
• 綜述62-67
• 參考文獻65-67
• 碩士期間發(fā)表論文情況67
• 獲得獎勵情況67-68
• 致謝68-69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 隋永領;邵峰;崔兆清;楊道貴;于俊秀;張彥波;魏法才;;直腸外翻切除結(jié)腸直腸(肛管)吻合術治療低位直腸癌28例報告[J];結(jié)直腸肛門外科;2007年01期

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：681829