本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子FOXM1不同剪接異構(gòu)體在乳腺癌EMT過程中的功能研究

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【摘要】：乳腺癌作為威脅女性健康最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在中國(guó)上升趨勢(shì)明顯。乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)特性是:能無限生長(zhǎng)、具有轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移能力。因此對(duì)乳腺癌進(jìn)行增殖、轉(zhuǎn)移等作用機(jī)制進(jìn)行深入研究,為腫瘤治療方案及臨床耐藥提供新的靶點(diǎn)。選擇性剪接是指將同一種前體m RNA剪接成多種不同的成熟m RNA剪接變異體,進(jìn)而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能不同的蛋白質(zhì)的過程。m RNA的選擇性剪接是真核生物產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性與基因表達(dá)復(fù)雜性的主要原因。研究發(fā)現(xiàn),在多種動(dòng)物組織中,至少90%蛋白編碼基因存在選擇性剪接現(xiàn)象。選擇性剪接導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的多樣性,與多細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞增殖、分化和死亡密切相關(guān)。研究選擇性剪接的發(fā)生機(jī)制、調(diào)控以及相應(yīng)蛋白異構(gòu)體的功能對(duì)于腫瘤的診斷和治療具有重要的意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)是指上皮類型細(xì)胞丟失上皮特性如細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用等現(xiàn)象,同時(shí)獲得了間質(zhì)表型如細(xì)胞移動(dòng)能力增強(qiáng)。EMT在胚胎的正常發(fā)育和組織器官的分化過程中扮演著重要的角色。EMT對(duì)胚胎的著床、原腸胚的形成、傷口愈合、組織再生和器官纖維化等生理和病理過程有重要作用,近年來研究認(rèn)為EMT是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移尤其是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲行為的重要分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子FOXM1是叉頭框(Forkhead box)家族成員,被發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤中都存在高表達(dá),如乳腺癌、肺癌等。研究證實(shí)FOXM1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了至關(guān)重要的作用,因而它也被認(rèn)為是預(yù)防腫瘤發(fā)生和腫瘤治療的潛在靶基因。目的:探究轉(zhuǎn)錄因子FOXM1不同的剪接異構(gòu)體對(duì)乳腺癌EMT過程中的影響。方法:采用基因工程方法分別構(gòu)建了表達(dá)FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP兩種FOXM1剪接異構(gòu)體真核表達(dá)質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺癌細(xì)胞,采用RT-PCR和Western印跡檢測(cè)細(xì)胞樣本中FOXM1剪接異構(gòu)體的表達(dá)和EMT相關(guān)基因表達(dá),同時(shí)采用transwell檢測(cè)高表達(dá)不同F(xiàn)OXM1剪接異構(gòu)體細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果:成功構(gòu)建了FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒。外源FOXM1B在乳腺癌間質(zhì)型細(xì)胞的表達(dá)高于上皮型細(xì)胞,并主要存在于細(xì)胞核內(nèi),且高表達(dá)FOXM1B能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和EMT過程。外源FOXM1C在乳腺癌上皮型細(xì)胞中的表達(dá)高于間質(zhì)型細(xì)胞,并且在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),高表達(dá)FOXM1C能夠顯著抑制細(xì)胞的侵襲和EMT過程。結(jié)論:乳腺癌細(xì)胞中,FOXM1B主要存在于細(xì)胞核內(nèi),FOXM1C在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。本研究預(yù)示FOXM1B和FOXM1C對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT過程發(fā)揮不同的影響。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌細(xì)胞 FOXM1B FOXM1C 遷移 EMT
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-25
• 1.1 乳腺癌概述14-15
• 1.2 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化——EMT過程15-19
• 1.2.1 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化概述15-16
• 1.2.2 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)功能16-17
• 1.2.3 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制17-19
• 1.2.4 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與表觀遺傳學(xué)19
• 1.3 真核生物mRNA的選擇性剪切與連接19-21
• 1.3.1 選擇性剪接的機(jī)制和模式19-20
• 1.3.2 選擇性剪接內(nèi)部外顯子的選擇調(diào)控20
• 1.3.3 選擇性剪接與腫瘤20-21
• 1.4 轉(zhuǎn)錄因子21-23
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄因子概述21
• 1.4.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1概述21-22
• 1.4.3 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的生物學(xué)功能22-23
• 1.4.4 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1與腫瘤23
• 1.5 本論文的工作設(shè)想23-25
• 第2章 內(nèi)源性FOXM1B/C表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞遷移能力25-39
• 2.1 前言25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器25-28
• 2.2.1 細(xì)胞25
• 2.2.2 其他材料和試劑25-27
• 2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器27-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法28-36
• 2.3.1 細(xì)胞株培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇28-29
• 2.3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)29
• 2.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.3.4 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及RT-PCR30-33
• 2.3.5 Western Blotting（WB）33-36
• 2.3.6 統(tǒng)計(jì)分析36
• 2.4 結(jié)果與討論36-39
• 2.4.1 研究體系的確定36-38
• 2.4.2 討論38-39
• 第3章 FOXM1B/C-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與胞內(nèi)表達(dá)39-51
• 3.1 前言39-40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器40-42
• 3.2.1 細(xì)胞和質(zhì)粒模板40
• 3.2.2 其他材料和試劑40-41
• 3.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器41-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-46
• 3.3.1 FOXM1融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建42-45
• 3.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染45-46
• 3.3.3 Western Blotting46
• 3.3.4 熒光觀測(cè)46
• 3.3.5 統(tǒng)計(jì)分析46
• 3.4 結(jié)果與討論46-51
• 3.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建46-47
• 3.4.2 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)47
• 3.4.3 FOXM1B/C在細(xì)胞內(nèi)的定位47-49
• 3.4.4 討論49-51
• 第4章 高表達(dá)FOXM1B促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程51-56
• 4.1 前言51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器51-53
• 4.2.1 細(xì)胞51
• 4.2.2 其他材料和試劑51-52
• 4.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器52-53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 4.3.1 細(xì)胞株培養(yǎng)53
• 4.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染53
• 4.3.3 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及RT-PCR53
• 4.3.4 Western Blotting（WB）53
• 4.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)53
• 4.3.6 統(tǒng)計(jì)分析53-54
• 4.4 結(jié)果與討論54-56
• 4.4.1 MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)FOXM1B各基因的表達(dá)情況54
• 4.4.2 MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)FOXM1B遷移能力的變化54-55
• 4.4.3 討論55-56
• 第5章 高表達(dá)FOXM1C抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程56-61
• 5.1 前言56
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器56-58
• 5.2.1 細(xì)胞56
• 5.2.2 其他材料和試劑56-57
• 5.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器57-58
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 5.3.1 細(xì)胞株培養(yǎng)58
• 5.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染58
• 5.3.3 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及RT-PCR58
• 5.3.4 Western Blotting（WB）58
• 5.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)58
• 5.3.6 統(tǒng)計(jì)分析58-59
• 5.4 結(jié)果與討論59-61
• 5.4.1 MDA-MB-231細(xì)胞中高表達(dá)FOXM1C各基因的表達(dá)情況59
• 5.4.2 MDA-MB細(xì)胞中高表達(dá)FOXM1C遷移能力的變化59-60
• 5.4.3 討論60-61
• 總結(jié)與展望61-63
• 1 結(jié)論61
• 2 展望61-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 附錄A 英文縮寫69-70
• 附錄B 常用緩沖液和試劑配方70-72
• 附錄C 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文72-73
• 致謝73

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