本文關(guān)鍵詞：癌基因TBC1D3的功能研究

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【摘要】：TBC1D3是一類在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中特有的并在人類基因組中出現(xiàn)重復(fù)的癌基因,在部分前列腺癌和乳腺癌中都發(fā)現(xiàn)了它的擴(kuò)增。擴(kuò)增是癌基因常見(jiàn)的激活方式,表現(xiàn)為包括雙微體和均質(zhì)染色區(qū)在內(nèi)的染色體異常所導(dǎo)致的基因拷貝數(shù)目的增加。TBC1D3發(fā)生擴(kuò)增的原因及其致癌機(jī)制尚未清楚。Hippo信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條在生理情況下控制器官大小的信號(hào)通路,它的異常調(diào)控會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在哺乳動(dòng)物中,經(jīng)典的Hippo信號(hào)通路由激酶Mstl/2,激酶Lats1/2以及它們的效應(yīng)蛋白YAP/TAZ構(gòu)成。我的研究發(fā)現(xiàn)TBC1D3是一個(gè)全新的Hippo信號(hào)通路調(diào)控基因,實(shí)驗(yàn)表明,它的過(guò)表達(dá)可以顯著激活Hippo通路下游的輔轉(zhuǎn)錄因子YAP和TAZ。為了更好地闡明TBC1D3對(duì)Hippo信號(hào)通路的調(diào)控作用,我構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)]HBC1D3C表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系,利用該細(xì)胞系進(jìn)行的一系列研究發(fā)現(xiàn),TBC1D3C可以與小G蛋白R(shí)hoA的鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF-H1直接相互作用,使其脫離細(xì)胞微管骨架而活化,之后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)激活RhoA�；罨腞hoA促使微絲發(fā)生聚合,對(duì)Lats1/2激酶進(jìn)行抑制,最終導(dǎo)致YAP和TAZ的去磷酸化激活�？偨Y(jié)來(lái)看,本研究發(fā)現(xiàn)了靈長(zhǎng)類動(dòng)物特有的基因TBC1D3通過(guò)抑制Hippo通路來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生的可能機(jī)制；提出了一個(gè)新的GEF-H1激活途徑；此外,更深入地闡明了Hippo信號(hào)通路從微管解聚到Y(jié)AP/TAZ激活的中間過(guò)程,深化了我們對(duì)細(xì)胞骨架調(diào)控Hippo通路的理解。
【關(guān)鍵詞】：TBC1D3 Hippo信號(hào)通路 RhoA GEF-H1
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 縮略詞表8-12
• 1 引言12-16
• 1.1 基因擴(kuò)增與癌癥發(fā)生12
• 1.2 TBClD3蛋白的基本介紹12-14
• 1.3 Hippo信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展14-15
• 1.4 GEF-H1與Rho家族介紹15-16
• 2 材料和方法16-26
• 2.1 胞系16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-19
• 2.2.1 主要溶液及配方16-18
• 2.2.2 主要試劑和抗體18-19
• 2.2.3 載體及菌株19
• 2.3 試驗(yàn)方法19-26
• 2.3.1 細(xì)胞總RNA的制備19-20
• 2.3.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA20
• 2.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR20-22
• 2.3.4 胞轉(zhuǎn)染22-23
• 2.3.5 Western blot免疫印跡檢測(cè)23
• 2.3.6 雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)23
• 2.3.7 蛋白純化23-24
• 2.3.8 免疫沉淀24
• 2.3.9 免疫熒光24-25
• 2.3.10 RBD pull down25
• 2.3.11 全細(xì)胞裂解液活化的鳥(niǎo)苷酸交換因子分析25-26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-58
• 3.1 TBC1D3誘導(dǎo)YAP/TAZ的去磷酸化及入核26-33
• 3.2 TBC1D3激活YAP/TAZ的關(guān)鍵位點(diǎn)及關(guān)鍵區(qū)域的鑒定33-38
• 3.3 TBC1D3依賴于RHOA來(lái)調(diào)控Hippo信號(hào)通路38-45
• 3.4 TBC1D3與GEF-H1直接相互作用并介導(dǎo)其從微管解離激活45-58
• 4 討論58-61
• 5 小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 作者簡(jiǎn)歷68

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