發(fā)布時間：2017-07-16 18:32

  本文關(guān)鍵詞：miR20a和miR20b對FIP200的調(diào)控及其對乳腺癌細胞自噬的作用研究

  更多相關(guān)文章： microRNA FIP200 細胞自噬 乳腺癌 基因表達調(diào)控 生物信息學(xué)

【摘要】：目的：細胞自噬(Autophagy)是真核細胞特有的生命現(xiàn)象,是高度保守的自我消化過程,在維持正常細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的平衡中發(fā)揮著重要的作用。FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200kD),是分子量大小為200kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白。FIP200是細胞自噬起始復(fù)合蛋白中的一個重要調(diào)控蛋白。ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合體在細胞自噬起始過程中起著重要作用。microRNA是一類高度保守、長度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA,約18-24個核苷酸,通過與目標(biāo)mRNA互補配對導(dǎo)致mRNA降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯誘導(dǎo)基因沉默。miRNA參與生命活動中多步重要進程,包括發(fā)育、分化、器官形成、衰老、凋亡、增殖、和癌癥的發(fā)生發(fā)展。目前,尚未有研究報道m(xù)icroRNA對FIP200的作用,本課題研究通過篩選靶向于FIP200的mircoRNA,并探討后者與乳腺癌細胞自噬的作用,闡明乳腺癌細胞中miRNA 與 FIP200的關(guān)系。方法：(1)篩選和鑒定直接調(diào)控FIP200表達的miRNA:為篩選出靶向于FIP200的microRNAs，本項目采用生物信息學(xué)軟件,分別有TargetScan、PicTar 和 miRanda,根據(jù)多個軟件預(yù)測出靶向于FIP200的microRNAs,選出共同預(yù)測到的10個nicroRNAs;采用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體分別構(gòu)建以上10個microRNAs,采用siCHECKTM-2 dual luciferase reporter plasmi d載體構(gòu)建FIP200 3'UTR和FIP200 3'UTR Mutant表達載體,將FIP200-3'UTR 和 microRNA表達載體共轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MCF7、MDB-MA-231,肺癌細胞A549,宮頸癌細胞Hela,肝癌細胞HepG2,通過雙螢光報告系統(tǒng)在不同細胞中隨機驗證篩選出下調(diào)FIP200的microRNAs共3個miR20a、miR20b和niR302a,進一步Western結(jié)果顯示過表達這些miRNA可以顯著降低FIP200蛋白表達的有兩個：miR20a和niR20b。(2)進一步確認篩選出的miRNAs對細胞自噬的調(diào)控：microRNAs的過表達,驗證FIP200的下調(diào)是否會抑制細胞自噬水平,本研究建立雷帕霉素(Rapamycin)誘導(dǎo)的細胞自噬模型,通過以下三種方法：Westemblotting檢測細胞自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達水平,激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬小體熒光顆粒的聚集,透射電鏡觀察自噬小體的結(jié)構(gòu)：siRNA干擾FIP200的表達,驗證microRNAs對細胞自噬的下調(diào)是否通過下調(diào)FIP200的表達來完成。(3)研究在乳腺癌細胞中micro RNA與FIP200的關(guān)系：為了驗證我們的結(jié)論,我們分別檢測了乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中內(nèi)源性miR20a、miR20b和FIP200的表達水平。確認在細胞內(nèi)miR20a以及miR20b與FIP200的關(guān)系。結(jié)果：生物信息學(xué)軟件分析說明FIP200 3'UTR有多個microRNAs的種子序列能與其結(jié)合。我們選取多個軟件共同預(yù)測到的并且種子序列與靶基因完全配對的10個microRNAs,分別為miR20a、miR20b、miR106b、miR133a、miR133b、miR302a、miR302b、 miR302c、 miR302d和miR372,在多個細胞系中隨機驗證,通過雙熒光報告系統(tǒng)結(jié)果顯示miR20a、miR20b、miR106b、miR302a、miR302b、miR302c、miR302d能抑制FIP200的表達。Western blotting結(jié)果顯示,在乳腺癌細胞中過表達以上miRNAs,其中miR20a和miR20b能顯著抑制FIP200蛋白的水平。我們的結(jié)果證明1niR20a和miR20b能調(diào)控FIP200的蛋白表達,進一步在細胞自噬模型中通過Western檢測細胞自噬標(biāo)志蛋白LC3、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬小體熒光顆粒的聚集、透射電鏡觀察自噬小體的結(jié)構(gòu),驗證了miR20a和miR20b能通過靶向于FIP200抑制細胞自噬水平。此外,我們檢測了人類正常乳腺細胞和乳腺癌細胞中miR20a和miR20b的內(nèi)源性表達水平,real time PCR結(jié)果顯示,miR20a和miR20b在乳腺癌細胞中的表達水平顯著低于正常細胞中的表達水平,Western結(jié)果顯示FIP200在乳腺癌細胞中高表達。這為我們通過miR20a和miR20b來治療乳腺癌提供了新的思路。結(jié)論：(1)miR20a和miR20b能夠抑制靶基因FIP200的表達。(2)miR20a和miR20b能抑制乳腺癌細胞中的細胞自噬水平。(3)miR20a和miR20b在乳腺癌細胞中低表達。(4)FIP200在乳腺癌細胞中高表達。
【關(guān)鍵詞】：microRNA FIP200 細胞自噬 乳腺癌 基因表達調(diào)控 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 緒言10-11
• 第一部分 文獻綜述11-27
• 一、細胞自噬的研究進展11-18
• 二、FIP200的研究進展18-19
• 三、microRNA的研究進展19-24
• 四、腫瘤的研究進展24-27
• 第二部分 實驗材料與方法27-48
• 一、實驗材料與儀器27-32
• 二、實驗方法32-48
• 第三部分 結(jié)果與討論48-70
• 第一章 靶向FIP200的miRNAs的篩選與鑒定48-59
• 第一節(jié) fip200的相關(guān)分析48
• 第二節(jié) 生物信息學(xué)預(yù)測48-50
• 第三節(jié) 細胞水平篩選實驗50-57
• 討論57-59
• 第二章 miR20a和miR20b在細胞自噬中的作用59-67
• 第一節(jié) 細胞自噬模型的建立59-60
• 第二節(jié) miR20a和miR20b對細胞自噬水平的調(diào)控60-66
• 討論66-67
• 第三章 乳腺癌細胞中miR20a,miR20b和FIP200的關(guān)系67-70
• 第一節(jié) 細胞內(nèi)源性miR20a和miR20b的表達水平67-68
• 第二節(jié) 細胞內(nèi)源性FIP200的表達水平68-69
• 討論69-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻71-77
• 致謝77-78
• 作者簡介78

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本文編號：550027