本文關(guān)鍵詞：蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素-2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]表達(dá)載體,驗(yàn)證構(gòu)建成功后將重組基因轉(zhuǎn)染進(jìn)宮頸癌He La細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞,檢測(cè)融合基因[M-IL-2(88Arg,125Ala)]在這兩種細(xì)胞中的表達(dá)以及檢測(cè)重組蛋白對(duì)宮頸癌He La細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的影響,為蜂毒肽和白介素2在腫瘤方面的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,并在引物上添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn),以p PICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala)為模板,使用PCR方法,獲得實(shí)驗(yàn)所需要的M-IL-2目的片段。以p LEGFP-C1和p EGFP-N3為載體構(gòu)建M-IL-2融合基因的真核表達(dá)載體p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,采用雙酶切和DNA序列的方法鑒定重組質(zhì)粒,鑒定成功后,使用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)宮頸癌He La細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中。M-IL-2融合蛋白在宮頸癌He La細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中的表達(dá)采用RT-PCR及Western blot的方法進(jìn)行檢測(cè),表達(dá)驗(yàn)證成功后使用CCK-8的方法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)融合蛋白的生活學(xué)活性,檢測(cè)其對(duì)宮頸癌He La細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果重組質(zhì)粒p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)經(jīng)過(guò)酶切及DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功,經(jīng)過(guò)RT-PCR及Western blot檢測(cè)證實(shí)重組基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在宮頸癌細(xì)胞He La,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中表達(dá),經(jīng)過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞流式儀分析融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)對(duì)以上兩種腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。結(jié)論真核表達(dá)載體pLEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)構(gòu)建成功,融合基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在He La細(xì)胞和U87細(xì)胞中表達(dá)且融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對(duì)宮頸癌細(xì)胞He La,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖具有一定的抑制作用,對(duì)Hela細(xì)胞的凋亡具有一定的促進(jìn)作用,為融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：白介素2 蜂毒肽 融合蛋白 真核表達(dá) 生物活性
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R73-3
【目錄】：

• 摘要2-3
• abstract3-6
• 引言6-8
• 第一章 材料與儀器8-13
• 1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)8
• 1.2 質(zhì)粒和菌株8
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及配制方法8-11
• 1.3.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑8-9
• 1.3.2 主要試劑配制方法9-11
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備11-13
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方法13-29
• 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建13-17
• 2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成14-16
• 2.1.2 目的基因擴(kuò)增及載體構(gòu)建16-17
• 2.2 重組質(zhì)粒擴(kuò)增17-18
• 2.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α17-18
• 2.2.2 菌株的保存18
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)18-20
• 2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇18-19
• 2.3.2 細(xì)胞傳代19
• 2.3.3 細(xì)胞凍存19-20
• 2.4 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化20-21
• 2.4.1 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染20-21
• 2.4.2 轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化21
• 2.5 檢測(cè)融合基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表達(dá)21-24
• 2.5.1 細(xì)胞總RNA的提取21-22
• 2.5.2 RT-PCR檢測(cè)外源基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表達(dá)22-24
• 2.6 細(xì)胞總蛋白的提取、檢測(cè)24-27
• 2.6.1 細(xì)胞總蛋白的提取24
• 2.6.2 Western-blot檢測(cè)目的蛋白24-27
• 2.7 融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響27-28
• 2.7.1 CKK-8 檢測(cè)融合蛋白表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞Hela、U87增殖的影響27-28
• 2.7.2 TUNEL法檢測(cè)融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala) 表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞Hela凋亡的影響28
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28-29
• 第三章 結(jié)果29-42
• 3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定29-32
• 3.1.1 提取重組質(zhì)粒pPICZαA/M-IL-2(88Arg, 125Ala)并鑒定29-31
• 3.1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定31-32
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)32-34
• 3.3. 融合蛋白M-IL-2(88Arg, 125Ala)在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)34-38
• 3.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染34-36
• 3.3.2 RT-PCR檢測(cè)M-IL-2(88Arg,125Ala)在Hela及U87細(xì)胞中m RNA的轉(zhuǎn)錄36-37
• 3.3.3 Western blot檢測(cè)M-IL-2(88Arg, 125Ala)在Hela及U87細(xì)胞中的表達(dá)37-38
• 3.4 CKK-8、TUNEL法檢測(cè)融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響38-42
• 3.4.1 CKK-8 檢測(cè)融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響38-40
• 3.4.2 TUNEL檢測(cè)融合蛋白表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響40-42
• 第四章 討論42-43
• 第五章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 文獻(xiàn)綜述47-55
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 攻讀學(xué)位期間研究成果55-56
• 致謝56-57

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王松;苗利光;李海濤;劉艷環(huán);王文昊;安亞雄;馮卓;;重組hIL-2表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá)[J];特產(chǎn)研究;2012年01期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 侯偉;26肽蜂毒素與基因變構(gòu)人白細(xì)胞介素2嵌合蛋白的原核表達(dá)、純化及活性測(cè)定[D];青島大學(xué);2004年

2 劉明軍;蜂毒素與基因變構(gòu)IL-2嵌合蛋白的純化工藝探索和生物學(xué)活性研究[D];青島大學(xué);2007年

3 董軍奎;重組蜂毒素-IL2體外活化免疫細(xì)胞及殺傷腫瘤細(xì)胞的活性研究[D];青島大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：486674