本文關鍵詞：基于cell-SELEX技術的惡性黑色素瘤細胞高侵襲性適配體篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]核酸適配體(Aptamer)是一類能特異性識別靶分子的單鏈DNA或RNA,可利用人工構建的隨機單鏈寡核苷酸文庫,通過SELEX技術篩選獲得。SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)是一種全新的組合化學技術。核酸適配體具有無免疫原性、性質(zhì)穩(wěn)定、可體外合成、成本低、高特異性等特性。因而成為腫瘤生物標記物篩選及分子靶向治療關注的焦點。惡性黑色素瘤是高死亡率的惡性腫瘤,云南地區(qū)高發(fā)。侵襲轉(zhuǎn)移是黑色素瘤患者主要致死原因。本研究利用cell-SELEX技術,以高侵襲性黑色素瘤細胞A2058為靶細胞,以期篩選出侵襲性惡性黑色素瘤相關的特異性核酸適配體,為轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤分子診斷和靶向治療提供新的候選靶標。[方法]本研究以人高侵襲性惡性黑色素瘤細胞株A2058作為靶細胞,人永生化上皮細胞Hacat為對照細胞,采用cell-SELEX技術,通過12輪篩選,富集特異性結(jié)合惡性黑色素瘤細胞A2058的特異性核酸適配體。同時利用流式細胞術,對篩得的次級文庫進行流式檢測,驗證其與高侵襲性惡性黑色素瘤細胞A2058的特異性結(jié)合能力。最后,通過高通量測序,結(jié)合DNA MEN及oligoanalyzer軟件預測核酸適配體序列的結(jié)構,在體外合成的次級文庫中獲取十條核酸適配體序列,再利用流式術驗證其與A2058細胞的特異性結(jié)合能力。[結(jié)果]1.通過cell-SELEX平臺富集適配體文庫·通過PCR擴增優(yōu)化退火溫度,確定50℃為最佳退火溫度根據(jù)引物Tm值,設定退火溫度區(qū)間為50℃～65℃。根據(jù)目的條帶的亮度、清晰度、彌散度及非特異性情況選取退火溫度。通過RT-PCR凝膠電泳發(fā)現(xiàn),在50℃退火溫度下,目的條帶亮度最大,條帶無彌散且無明顯非特異性條帶。因此,確定50℃為PCR擴增最佳退火溫度�！ねㄟ^PCR擴增優(yōu)化引物濃度,確定5uM為最佳引物濃度在相同的PCR反應體系下,設置不同引物濃度梯度：1μM,2uM,3uM, 4uM,5uM,6uM,7uM,8μM,9uM。根據(jù)目的條帶的亮度、清晰度、彌散度及非特異性情況選取引物濃度。在5uM引物濃度下,目的條帶亮度最大,條帶無彌散且無明顯非特異性條帶。因此,確定5uM為PCR擴增最佳引物濃度。·優(yōu)化篩選條件,富集最佳適配體文庫通過調(diào)整篩選壓力,提高篩選所得核酸適配體的特異性和親和力,同時利用RT-PCR技術確定每輪篩選PCR擴增最佳循環(huán)數(shù)。在此條件下,經(jīng)過12輪篩選,獲得了針對人惡性黑色素瘤細胞A2058的富集文庫,通過流式細胞術實驗證實,篩選得到的次級文庫可特異性識別惡性黑色素瘤細胞A2058,而對對照細胞Hacat無識別。2.高通量測序及核酸適配體的結(jié)構信息分析對第12輪ssDNA文庫進行高通量測序,可見文庫有良好富集。利用DNAMEN和oligoanalyzer軟件對前20條序列進行結(jié)構信息分析,發(fā)現(xiàn)序列一級結(jié)構根據(jù)同源性可分四部分；二級結(jié)構以莖環(huán)結(jié)構為主。3.流式細胞術檢測核酸適配體與細胞的結(jié)合情況經(jīng)流式細胞術驗證,獲得3條可特異性識別人惡性黑色素瘤細胞A2058的核酸適配體序列：Seq7, Seq8, Seq10,研究發(fā)現(xiàn),Seq7, Seq8, Seq10可特異性識別A2058細胞,但識別能力欠佳。[結(jié)論]通過cell-SELEX技術可篩選出特異性結(jié)合人惡性黑色素瘤細胞A2058的核酸適配體。Seq7, Seq8, Seq10可特異性識別人惡性黑色素瘤細胞A2058。
【關鍵詞】：核酸適配體 Cell-SELEX技術 惡性黑色素瘤 轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-29
• 結(jié)果29-44
• 討論44-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻48-53
• 綜述53-62
• 參考文獻58-62
• 攻讀學位期間獲得的學術成果62-63
• 致謝63-64

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