目的:胃癌是常見的惡性腫瘤,常常在診斷時發(fā)現存在遠處轉移。胃癌治療失敗常常是廣泛侵襲和遠處轉移所引起的,就是說這種侵襲、轉移是主要的治療失敗模式,也是患者主要的死因也是侵襲和轉移。因此,提高胃癌整體治療結局的關鍵在于闡明胃癌發(fā)生侵襲轉移的機制并建立控制侵襲轉移的有效方法。ARHI是1999年發(fā)現的母源性印記抑癌基因,以往研究發(fā)現在多種惡性腫瘤中ARHI表達下調,并且參與抑制增殖、抑制遷移、調控細胞周期等。目前,ARHI與胃癌自噬以及侵襲轉移關系的系統(tǒng)研究尚未見報告。本研究擬構建ARHI再表達胃癌細胞株,采用體外細胞學實驗觀察評估ARHI基因對胃癌細胞增殖、自噬、凋亡、遷移、侵襲等惡性生物學行為的影響;采用裸鼠荷瘤模型實驗評估ARHI基因對胃癌細胞皮下移植瘤生長及血行播散轉移的影響,并探討相關分子機制,旨在系統(tǒng)完整地闡釋ARHI基因調控胃癌細胞生物學行為的作用機制,客觀評估其作為抗胃癌侵襲轉移治療新靶點的價值。材料和方法:1、構建ARHI基因穩(wěn)定高表達胃癌細胞株。常規(guī)培養(yǎng)人胃癌細胞株BGC-823、SGC-7901、MKN-45、NCI-N87和人永生化胃粘膜上皮細胞株GES-1。采用R...

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【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 ARHI基因再表達對BGC823胃癌細胞生物學行為的影響及機制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 材料與儀器
            2.1.1 主要材料
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 多種細胞系中ARHI轉錄、翻譯水平的檢測
            2.2.2 穩(wěn)定再表達ARHI基因胃癌細胞株ARHI-BGC823的建立
            2.2.3 穩(wěn)定高表達ARHI基因胃癌細胞株ARHI-BGC823的鑒定
            2.2.4 ARHI基因過表達對胃癌細胞BGC823生物學行為的影響
            2.2.5 ARHI基因對BGC823胃癌細胞系調控機制的探索
        2.3 統(tǒng)計學方法
    3 結果
        3.1 正常胃粘膜上皮細胞及胃癌細胞系中ARHI轉錄、翻譯水平
            3.1.1 正常胃粘膜上皮細胞及4種胃癌細胞系中ARHI轉錄水平
            3.1.2 胃癌細胞系中ARHI蛋白表達水平
            3.1.3 ARHI蛋白在正常胃粘膜上皮細胞及4種胃癌細胞中表達
        3.2 穩(wěn)定高表達ARHI基因胃癌細胞株ARHI-BGC823的建立
            3.2.1 ARHI質粒、空載質粒的鑒定
            3.2.2 ARHI質粒瞬時轉染效率評價
            3.2.3 穩(wěn)定轉染細胞系的建立
        3.3 穩(wěn)定高表達ARHI基因胃癌細胞株ARHI-BGC823的鑒定
            3.3.1 穩(wěn)定轉染細胞系綠色熒光標簽蛋白表達
            3.3.2 穩(wěn)定轉染細胞系中ARHImRNA轉錄水平
            3.3.3 穩(wěn)定轉染細胞系中ARHI蛋白表達水平
            3.3.4 穩(wěn)定轉染細胞系中再表達ARHI蛋白的細胞內定位
        3.4 體外實驗評估ARHI基因對胃癌細胞BGC823生物學行為的影響
            3.4.1 ARHI基因再表達可顯著抑制胃癌細胞BGC823增殖活性
            3.4.2 ARHI基因再表達可誘導胃癌細胞BGC823凋亡
            3.4.3 ARHI再表達可誘導胃癌細胞的自噬
            3.4.4 ARHI基因過表達可抑制BGC823胃癌細胞的遷移能力
            3.4.5 ARHI基因過表達抑制胃癌細胞BGC823的侵襲能力
        3.5 ARHI基因過表達影響胃癌細胞生物學行為的機制探討
            3.5.1 ARHI基因過表達誘導細胞周期G0/G1期阻滯
            3.5.2 ARHI下調ERK信號通路活性抑制細胞增殖、誘導凋亡
            3.5.3 ARHI再表達可能通過逆轉EMT抑制細胞遷移、侵襲
            3.5.4 ARHI再表達可能通過下調SP1/VEGF抑制胃癌細胞誘導血管生成的能力
            3.5.5 ARHI可能通過下調PI3K-AKT-mTOR通路活性抑制惡性行為
            3.5.6 BGC823胃癌細胞ARHI失活的原因包括啟動子甲基化和組蛋白去乙�；�
    4 討論
    5 結論
第二部分 ARHI基因再表達對BGC823胃癌細胞裸鼠皮下成瘤及血行播散轉移的影響及機制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實驗動物與試劑
        2.2 裸小鼠皮下荷瘤模型構建
            2.2.1 裸鼠飼養(yǎng)
            2.2.2 裸鼠皮下接種移植瘤
            2.2.3 皮下移植瘤生長情況觀察
            2.2.4 qRT-PCR檢測ARHI、p62mRNA在皮下移植瘤組織的表達水平
            2.2.5 免疫組化法檢測移植瘤組織中相關蛋白表達
        2.3 裸小鼠血行播散轉移模型構建
            2.3.1 腫瘤細胞尾靜脈接種
            2.3.2 大體測量、取材、常規(guī)病理組織標本制備
            2.3.3 組織形態(tài)學觀察
            2.3.4 腫瘤生長、轉移相關生物標志物的檢測分析
        2.4 統(tǒng)計學分析方法
    3 結果
        3.1 ARHI基因再表達對皮下移植瘤生長的影響及機制研究
            3.1.1 ARHI再表達顯著抑制皮下移植瘤的生長
            3.1.2 ARHI再表達顯著上調皮下移植瘤癌細胞的自噬水平
            3.1.3 ARHI再表達顯著抑制皮下移植瘤癌細胞的增殖活性
            3.1.4 ARHI再表達明顯抑制皮下移植瘤微血管生成
            3.1.5 ARHI再表達影響皮下移植瘤中p-AKT和α-Catenin的表達
            3.1.6 ARHI再表達顯著上調皮下移植瘤癌細胞MIIP的表達
        3.2 ARHI再表達抑制血行播散胃癌細胞在肺、肝形成轉移瘤的能力
    4 討論
    5 結論
第三部分 胃癌組織中ARHI、LC3B、p62表達與臨床病理因素和預后的關系及意義
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 臨床病理資料
            2.1.1 臨床標本收集
            2.2.2 臨床病理資料
        2.2 免疫組織化學染色評價ARHI、p62、LC3B蛋白表達水平
            2.2.1 組織芯片的構建
            2.2.2 主要儀器
            2.2.3 免疫組織化學染色與結果判定
        2.3 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 ARHI、p62、LC3B蛋白在正常胃粘膜和胃癌組織中的表達
        3.2 ARHI、p62、LC3B蛋白表達的的相關性
        3.3 ARHI、p62、LC3B蛋白表達與胃癌臨床病理因素的相關性
        3.4 ARHI、p62、LC3B蛋白表達與患者預后的關系
    4 討論
    5 結論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號：3857881