腫瘤作為慢性非傳染疾病已成為危害人類健康并導(dǎo)致死亡的頭號殺手,世衛(wèi)組織發(fā)布的最新癌癥報告顯示惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率依然呈現(xiàn)迅猛增長的趨勢。因此從細(xì)胞分子水平研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制,為腫瘤的治療及預(yù)防奠定基礎(chǔ)有著迫切的需要。隨著近年來分子影像學(xué)的發(fā)展,高分辨高速的活細(xì)胞成像顯微鏡系統(tǒng)日益成熟,這就為從細(xì)胞層面動態(tài)研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。而如何應(yīng)用該技術(shù),達(dá)到篩查治療腫瘤有效化學(xué)藥物的目標(biāo),迫切需要構(gòu)建一種能夠反映化療藥物是否損傷腫瘤細(xì)胞的、穩(wěn)定表達(dá)微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的熒光報告細(xì)胞系模型,通過觀察腫瘤細(xì)胞的行為變化,為腫瘤的治療提供有效的化療藥物篩查的工具。細(xì)胞周期的錯誤調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞周期中的有絲分裂過程是一個精細(xì)調(diào)節(jié)的過程,其中每一對染色體都需要正確的連接來自于兩極的微管,如果著絲粒與微管的附著錯誤就會導(dǎo)致染色體的排列錯誤,進(jìn)而導(dǎo)致染色體分離的異常,促進(jìn)染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生,最終產(chǎn)生非整倍體的細(xì)胞,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。為了更直觀的精確研究染色體與微管的運(yùn)動結(jié)合過程,預(yù)期構(gòu)建標(biāo)記GFP綠色熒光蛋白質(zhì)的微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞系,從而利用活細(xì)胞顯微工作站來... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

凝膠電泳顯示PCR片段結(jié)果

圖 2： 凝膠電泳顯示酶切載體前后結(jié)果切的載體與目的片段的連接與轉(zhuǎn)化接體系：體與目的片段的摩爾數(shù)比=1：3 or 5buffer 1.5 μl X片段 X酶 1 μl2O Xal 15 μl連接過夜。（一般大于 8h）化（一般取連接產(chǎn)物的一半做轉(zhuǎn)化）

圖 3： 菌落生長顯示片段與載體連接結(jié)果左圖為自連對照，右圖為連接體系如圖所示，載體自連對照組未見菌落，而重組轉(zhuǎn)化組可見.5 菌液 PCR 鑒定及測序鑒定a) 用無菌的 10μl 槍頭挑取單克隆菌落（一般挑取 3-5 個）那霉素抗性的 LB 培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng) 4h。b) 待培養(yǎng)基變渾濁，取 1μl 菌液進(jìn)行。（PCR 體系同上所c) 瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌液 PCR 結(jié)果。d) 將陽性菌落的菌液送至 invitrogen 公司測序。從 PCR 的結(jié)果可以看出，所挑取的 5 個克隆有 3 個陽Marker — + 1# 2# 3# 4#


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