癌癥作為全球主要的公共健康問題,已經成為第二大致死性疾病。而癌癥的高發(fā)生、高致死率與癌細胞的增殖分化異常及浸潤轉移能力增強密切相關。大量研究表明,糖基化修飾異常會改變細胞的生物學特征。已有報道證實糖基轉移酶IVa(GnT-IVa)和糖基轉移酶V(GnT-V)的表達異常都能夠影響癌細胞的上皮間質樣轉化(EMT),GnT-V過表達可以促進腫瘤的生長。但關于GnT-IVa能夠調節(jié)腫瘤發(fā)生及細胞分化的報道較少。在課題組前期的研究工作中,我們發(fā)現幾種常見的癌癥,比如肝癌,絨毛膜癌及宮頸癌中GnT-IVa在癌組織中的表達量比癌旁組織高,且初步的裸鼠成瘤實驗表明過表達GnT-IVa的確可以促進腫瘤的形成。因此,為了初步探索GnT-IVa對癌細胞增殖影響的機制,我們主要利用MTT、克隆形成、流式細胞術、qRT-PCR、Western Blot、co-IP及LC-MS/MS等技術手段對細胞增殖形態(tài)、細胞周期分布及相關信號分子的改變三個方面進行了研究。本實驗中,我們選取了實驗室已有的細胞系模型:內源低表達GnT-IVa的AV3細胞及其GnT-IVa穩(wěn)轉株AV3/GnT-IVa和內源高表達GnT-IVa的HepG2細胞進行相關實驗。結果顯示,將GnT-IVa過表達后,AV3細胞的增殖能力明顯提高。利用靶向GnT-IVa的siRNA對過表達或高表達GnT-IVa的細胞系進行干擾沉默,細胞的增殖能力下降,且增殖相關分子Ki67的mRNA表達下調。這初步說明GnT-IVa能夠促進癌細胞增殖。進而我們利用流式細胞儀檢測了AV3,AV3/GnT-IVa,AV3/si-NC,AV3/si-GnT-IVa,HepG2,HepG2/si-NC和HepG2/si-GnT-IVa這幾種細胞的凋亡率及細胞周期。初步發(fā)現GnT-IVa是通過促進癌細胞G1/S期的進程來提高增殖能力,而對凋亡沒有明顯的影響。隨后利用實時定量PCR和蛋白質免疫印記技術分別檢測了周期相關分子CyclinD1和CyclinD2,發(fā)現糖基轉移酶IVa能夠促進這兩種周期蛋白的表達水平。為了進一步探明GnT-IVa參與調控細胞周期的中間分子,我們借助LC-MS/MS對凝集素DSL免疫沉淀下來的AV3,AV3/GnT-IVa和AV3/si-GnT-IVa蛋白樣品進行定性分析,發(fā)現含有N-糖鏈的膜蛋白Integrinβ1存在變化。利用qRT-PCR和Western Blot技術檢測發(fā)現Integrinβ1的表達受GnT-IVa正向調控。利用已有的抗體對Integrinβ1免疫沉淀后進行凝集素Blot,發(fā)現Integrinβ1的β1,4糖鏈也明顯增多。另外,利用靶向Integrinβ1的siRNA在AV3/GnT-IVa和HepG2中進行沉默干擾后,流式細胞儀檢測結果顯示G1/S期受到阻滯。我們進一步利用qRT-PCR,Western Blot分析了Integrinβ1/FAK增殖通路中的幾個關鍵信號分子p-ERK和c-Myc的表達情況。結果發(fā)現這兩個分子均與GnT-IVa表達成正相關。因此,我們初步得出結論GnT-IVa可能通過糖基化Integrinβ1,從而調控了Integrinβ1參與的細胞增殖通路。綜上所得,GnT-IVa能夠通過加快癌細胞增殖促進腫瘤的形成。它可能通過糖基化細胞膜蛋白Integrinβ1,刺激下游信號分子,導致FAK,P-ERK和c-Myc表達升高,從而促進了G1/S特異性周期蛋白cyclinD1和cyclinD2的表達成熟,進而加快了癌細胞的增殖。本研究為闡明糖基化修飾對細胞增殖的影響奠定了基礎,也為GnT-IVa的深入研究開辟了新思路。
【學位單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R73-3
【部分圖文】：

圖 1-1 生長因子信號調節(jié)細胞外營養(yǎng)物質的攝取和代謝幾十年中，針對不同類型的增殖細胞的研究出現中的代謝與靜息細胞中的新陳代謝不同的是其糖他大分子的生物合成速率很高（圖 1-2）。Ralph 代謝活動的作用以及在增殖過程中補充三羧酸（rosis）。他們還討論了關于信號轉導途徑如何影響營養(yǎng)物質，能量和生物合成的活性可以保證每次子組分。 因此，增殖細胞中的代謝活性與非增殖

圖 1-1 生長因子信號調節(jié)細胞外營養(yǎng)物質的攝取和代謝[17]幾十年中，針對不同類型的增殖細胞的研究出現一致的中的代謝與靜息細胞中的新陳代謝不同的是其糖酵解，他大分子的生物合成速率很高（圖 1-2）。Ralph J.DeBe代謝活動的作用以及在增殖過程中補充三羧酸（TCA）rosis）。他們還討論了關于信號轉導途徑如何影響細胞代營養(yǎng)物質，能量和生物合成的活性可以保證每次通過細子組分。 因此，增殖細胞中的代謝活性與非增殖細胞中過考察幾種核心通量，包括有氧糖酵解，脂質生物合成性，形成支持不同細胞類型增殖的固有平臺。 他們還假過信號轉導和基因表達的細胞介質（包括磷脂酰肌醇 3- 系統(tǒng)，缺氧誘導因子 1（HIF-1）和 Myc）調節(jié)這些通量和

哈爾濱工業(yè)大學理學碩士學位論文管疾病的病因學中起關鍵作用。蛋白聚糖可能是生物學中最復雜和分子，蛋白質組學的研究進展已經開始加速[39]。幾乎所有感染人類毒都通過與特定細胞表面聚糖識別而與細胞結合。糖組學和聚糖陣傳染病的診斷和預研究產生重大影響。床癌癥診斷標記通常是糖蛋白，但大多數目前的診斷測試僅測量多然，鑒于與癌癥相關的聚糖長期已知的改變，檢測蛋白質的特定糖物極有可能對癌癥的早期檢測具有更高的靈敏度和特異性[40]。因此蛋白組學的趨同發(fā)現是用于癌癥早期檢測的生物標志物的關鍵[41]。品和藥物管理局批準講巖藻糖基化的甲胎蛋白作為原發(fā)性肝癌的診外，巖藻糖基化的觸珠蛋白相比簡單監(jiān)測觸珠蛋白多肽的表達能夠腺癌標志物。用以鑒定人類疾病的生物標志物的系統(tǒng)生物學分析 gly用與基因組學，蛋白質組學，代謝組學和脂質組學相同的方法（圖 1
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本文編號：2867004