背景和目的:上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。異常激活的白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)/Janus蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosinekinase,JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和活化轉(zhuǎn)錄因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生,促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展,但其在肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病機(jī)制中的研究仍較少。本實驗通過體外研究探討IL-6/JAK/STAT3和Smad3(Sekelsky mothers against d PP 3,Smad3)/轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)信號通路在肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生過程中的相互作用及分子機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株Hep G2、Bel7402、MHCC97H、HCCLM3,依據(jù)四種肝癌細(xì)胞株中的磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和活化轉(zhuǎn)錄因子3(phosphorylated STAT3,pSTAT3)的蛋白表達(dá)情況,選擇肝癌細(xì)胞株Hep G2、HCCLM3進(jìn)行研究。分別或聯(lián)合予TGF-β1、IL-6、α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490)處理肝癌細(xì)胞株Hep G2、HCCLM3后,采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Zinc finger transcriptional factor,Snail)的信使核糖核酸(messenger Ribonucleic Acid,m RNA)表達(dá)水平,蛋白免疫印跡法檢測p-STAT3/STAT3、p-Smad3(phosphorylated Sekelsky mothers against d PP 3)/Smad3及EMT相關(guān)分子標(biāo)志物Snail、E-鈣黏蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、波形蛋白(Vimentin,Vim)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:以TGF-β1(0,2,5,10ng/ml濃度)孵育肝癌細(xì)胞株(Hep G2)24小時后,首先,我們觀察到肝癌細(xì)胞株Hep G2細(xì)胞逐漸失去原有的極性,由圓形或者橢圓形(上皮表型)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮位蛘叩湫偷某衫w維細(xì)胞樣表型(間質(zhì)表型),隨著TGF-β1孵育濃度的增高,間質(zhì)表型的改變也更加明顯,以TGF-β1 10ng/ml濃度孵育的作用最顯著;其次,我們收集Hep G2細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理Hep G2細(xì)胞24小時后,E-Cadherin的蛋白表達(dá)水平降低,Vimentin、Snail、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平升高,且與TGF-β1的劑量成正相關(guān),而STAT3的蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。隨后以TGF-β1 10ng/ml濃度孵育肝癌細(xì)胞株Hep G2不同時間點(0,0.5,1,2,4,8小時)后,我們收集Hep G2細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)隨著TGF-β1孵育時間的延長,p-STAT3、Snail、p-Smad2、pSmad3的蛋白表達(dá)水平逐漸升高,STAT3、Smad4的蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。證明TGF-β1可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株Hep G2的EMT轉(zhuǎn)化,以TGF-β1 10ng/ml刺激8小時效果最顯著。以IL-6(0,50,100ng/ml濃度)孵育肝癌細(xì)胞株(Hep G2和HCCLM3)1小時后,我們收集Hep G2、HCCLM3細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)在這兩種肝癌細(xì)胞株中,p-STAT3的蛋白表達(dá)水平均隨著IL-6孵育濃度的增加而逐漸升高,以IL-6 100ng/ml濃度組p-STAT3蛋白上調(diào)最明顯。分別或聯(lián)合予TGF-β1 5ng/ml、IL-6 50ng/ml孵育肝癌細(xì)胞株Hep G2、HCCLM3 1小時后,首先,我們收集Hep G2、HCCLM3這兩種細(xì)胞后提取細(xì)胞m RNA行q RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)IL-6+TGF-β1聯(lián)合處理組較單用TGF-β1組的Snail m RNA表達(dá)水平升高更明顯(TGFβ1+IL-6 versus TGF-β1:Hep G2 p=0.003;HCCLM3 p=0.008);其次,我們收集Hep G2、HCCLM3細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)在這兩種肝癌細(xì)胞株中IL-6+TGF-β1聯(lián)合處理組相比于單用IL-6或TGF-β1組的p-Smad3和Snail蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),同時顯著降低E-Cadherin的蛋白表達(dá)水平、升高Vimentin的蛋白表達(dá)水平,證明IL-6+TGF-β1聯(lián)合處理組較單用IL-6或TGF-β1組促進(jìn)肝癌細(xì)胞株Hep G2、HCCLM3發(fā)生EMT的效果更顯著。AG490是一種JAK2的特異性抑制劑,以AG490(0,50,100u M濃度)孵育肝癌細(xì)胞株(Hep G2和HCCLM3)4小時后,我們收集Hep G2、HCCLM3細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)在這兩種肝癌細(xì)胞株中,p-STAT3的蛋白表達(dá)水平均隨著AG490孵育濃度的增加而逐漸降低,以AG490 100u M濃度組p-STAT3蛋白下調(diào)最明顯。分別或聯(lián)合予TGF-β1 5ng/ml、AG490 50u M孵育肝癌細(xì)胞株Hep G2、HCCLM3 4小時后,首先,我們收集Hep G2、HCCLM3這兩種細(xì)胞后提取細(xì)胞m RNA行q RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)AG490+TGF-β1聯(lián)合處理組較單用TGF-β1組的Snail m RNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(AG490+TGF-β1 vs TGF-β1:Hep G2 p=0.013;HCCLM3 p=0.022);其次,我們收集Hep G2、HCCLM3細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)在這兩種肝癌細(xì)胞株中AG490+TGF-β1組相比于單用TGF-β1組的pSmad3和Snail蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),同時顯著升高E-Cadherin的蛋白表達(dá)水平、降低Vimentin的蛋白表達(dá)水平,證明AG490可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞株Hep G2、HCCLM3的EMT發(fā)生。結(jié)論:STAT3在TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生過程中作為一個正向調(diào)控因子,STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可加重TGF-β1誘導(dǎo)的體外肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,從而加重肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文2.結(jié)果 在不同肝癌細(xì)胞株中的基礎(chǔ)表達(dá)水平 STAT3 在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，我們應(yīng)用蛋白免疫印胞株（HepG2、Bel7402、MHCC97H、HCCLM3）中 p-ST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種肝癌細(xì)胞株中 p-STAT3 均呈現(xiàn)基礎(chǔ)表達(dá)水 HCCLM3 細(xì)胞株相比，HepG2 和 Bel7402 中 p-STAT3 表達(dá)選取其中 p-STAT3 表達(dá)較低的 HepG2細(xì)胞株和 p-STAT3表胞株用于細(xì)胞實驗（圖 1）。

圖 2 TGF-β1 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞 HepG2 發(fā)生 EMTFigure 2 The occurrence of EMT can be induced by TGF-β1 in HepG2圖 2 倒置顯微鏡觀察不同濃度 TGF-β1(0, 2, 5,10ng/ml)刺激 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 24小時后細(xì)態(tài)學(xué)的變化（×10）。2.3 TGF-β1 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞 EMT 發(fā)生過程中 IL-6/STAT3 信號通路被激活為了觀察不同濃度的 TGF-β1處理肝癌細(xì)胞 HepG2發(fā)生 EMT過程中的相白表達(dá)量和 p-STAT3 及 STAT3 表達(dá)水平，我們進(jìn)行蛋白免疫印跡實驗結(jié)果發(fā)著 TGF-β1處理濃度的升高，上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-鈣黏蛋白（E-Cadherin, E-Ca達(dá)水平逐漸下降，以 10ng/ml 效果最顯著，而反應(yīng)間質(zhì)轉(zhuǎn)化的蛋白 Vimenti水平逐漸上調(diào)，以 10ng/ml 效果最顯著。同時 p-STAT3、Snail 蛋白表達(dá)量液升高，而總 STAT3 表達(dá)量不變。此實驗從蛋白表達(dá)水平再次證明 TGF-β1 可HepG2 發(fā)生 EMT 且處理效果與其濃度呈正相關(guān)，同時 EMT 發(fā)生過程中伴

gure 2 The occurrence of EMT can be induced by TGF-β1 in HepG2觀察不同濃度 TGF-β1(0, 2, 5,10ng/ml)刺激 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 24小時10）。導(dǎo)的肝癌細(xì)胞 EMT 發(fā)生過程中 IL-6/STAT3 信號通路被激不同濃度的 TGF-β1處理肝癌細(xì)胞 HepG2發(fā)生 EMT過程中p-STAT3 及 STAT3 表達(dá)水平，我們進(jìn)行蛋白免疫印跡實驗結(jié)理濃度的升高，上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-鈣黏蛋白（E-Cadherin, E降，以 10ng/ml 效果最顯著，而反應(yīng)間質(zhì)轉(zhuǎn)化的蛋白 Vim，以 10ng/ml 效果最顯著。同時 p-STAT3、Snail 蛋白表達(dá)STAT3 表達(dá)量不變。此實驗從蛋白表達(dá)水平再次證明 TGF-EMT 且處理效果與其濃度呈正相關(guān)，同時 EMT 發(fā)生過程中通路的激活。
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本文編號：2841412