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RIP3調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機(jī)制及其與人結(jié)腸癌關(guān)系的研究

發(fā)布時(shí)間:2020-09-24 07:32
   結(jié)直腸癌(Colorectalcancer,CRC)是臨床上最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近些年來(lái),隨著人們生活水平不斷提高和飲食習(xí)慣發(fā)生改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅著人類健康。盡管以手術(shù)為主、放化療為輔的傳統(tǒng)治療模式有了很大改進(jìn),但晚期結(jié)腸癌的治療仍不滿意,患者總體生存率并無(wú)顯著提高。因此,尋找行之有效的其他療法配合甚至取代手術(shù)治療,對(duì)降低結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)率和病死率,提高其治愈率和改善患者的生活質(zhì)量具有重要性。細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)自我降解的方式,是將細(xì)胞內(nèi)受損、變形、衰老或失去功能的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w,并進(jìn)行消化和降解的過(guò)程。這一過(guò)程對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持是必需的,也是細(xì)胞抵御病原體的保護(hù)機(jī)制。細(xì)胞自噬與腫瘤的關(guān)系非常復(fù)雜,目前認(rèn)為在腫瘤發(fā)生時(shí)細(xì)胞自噬起到抑制作用,但在腫瘤發(fā)展的進(jìn)程中,細(xì)胞自噬又可能為腫瘤細(xì)胞提供對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)缺乏和缺氧的機(jī)制,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。細(xì)胞自噬是許多腫瘤抵御化療藥物的機(jī)制,但在某些情況下,細(xì)胞自噬在腫瘤細(xì)胞的抗癌藥物介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用,促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡卻又是某些腫瘤治療的有效手段。隨著自噬研究現(xiàn)象的深入,自噬逐漸成為一個(gè)新的癌癥治療靶點(diǎn)。首先在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中分別轉(zhuǎn)染RIP3 shRNA干擾質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,用無(wú)糖培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,發(fā)現(xiàn)敲低RIP3后細(xì)胞自噬減弱,而過(guò)表達(dá)RIP3后細(xì)胞自噬增強(qiáng)。我們首次發(fā)現(xiàn):RIP3能夠促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的細(xì)胞自噬。接著,對(duì)RIP3調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的可能分子機(jī)制展開(kāi)進(jìn)一步的深入研究。首先,WesternBlotting結(jié)果顯示葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞自噬并不依賴于經(jīng)典的mTOR信號(hào)途徑。通過(guò)質(zhì)譜研究發(fā)現(xiàn),RIP3與結(jié)腸癌中可能參與細(xì)胞自噬的G蛋白GNAI3和G蛋白調(diào)節(jié)因子RGS19相互作用,用免疫共沉淀方法進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。我們推測(cè)RIP3可能通過(guò)與GNAI3和RGS19的相互作用介導(dǎo)了結(jié)腸癌的細(xì)胞自噬。盡管,RIP3敲低或過(guò)表達(dá)后,GNAI3和RGS19的表達(dá)量不發(fā)生改變,但是,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GNAI3或RGS19的表達(dá)下調(diào)會(huì)抑制HT29細(xì)胞自噬,并且GNAI3的GTPase酶活性能夠促進(jìn)HT29細(xì)胞自噬。RIP3是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶,我們推測(cè)RIP3可能通過(guò)其激酶活性而影響了細(xì)胞自噬,通過(guò)將激酶活性點(diǎn)突變的RIP3表達(dá)質(zhì)粒回補(bǔ)到RIP3敲低的細(xì)胞中,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后發(fā)現(xiàn)RIP3的激酶活性確實(shí)能夠促進(jìn)HT29細(xì)胞自噬,且其發(fā)揮作用的激酶活性中心為K50。體外激酶活性分析實(shí)驗(yàn)表明RIP3激酶能夠分別磷酸化GNAI3和RGS19。因此,我們猜測(cè)RIP3激酶可能通過(guò)磷酸化GNAI3和RGS19而影響了葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞自噬。應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析篩選出一些可能的磷酸化位點(diǎn),GNAI3可能被RIP3激酶磷酸化的位點(diǎn)有:S6和S164;RGS19可能被RIP3激酶磷酸化的位點(diǎn)有:T12、S199、S213和S214。此外,為了尋找葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞自噬中,RIP3可能的上下游蛋白,除了GNAI3和RGS19,應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析還篩選出了 ACAA1和DDX24兩個(gè)蛋白。有研究報(bào)道ACAA1和DDX24與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系,但是其是否參與細(xì)胞自噬,目前沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。這有待于我們后續(xù)的進(jìn)一步深入研究。為了考查RIP3調(diào)控的細(xì)胞自噬在人結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展和治療中的影響,我們應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、MTT法檢測(cè)耐藥性和裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RIP3調(diào)控的細(xì)胞自噬對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。研究結(jié)果顯示敲低RIP3后,HT29細(xì)胞生長(zhǎng)增快,集落形成能力增強(qiáng),誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后的細(xì)胞增殖抑制率降低,裸鼠皮下移植瘤體積增大;而過(guò)表達(dá)RIP3后,HT29細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,集落形成能力減弱,裸鼠皮下移植瘤體積減小。敲低RIP3后,加入無(wú)糖培養(yǎng)液誘導(dǎo),HT29細(xì)胞的增殖抑制率降低,說(shuō)明RIP3的低表達(dá)可以通過(guò)降低細(xì)胞自噬水平而提高其存活率;而加入化療藥物5-FU后,HT29細(xì)胞的增殖抑制率升高,說(shuō)明RIP3的低表達(dá)可能通過(guò)降低了細(xì)胞的自噬水平從而增加了 HT29對(duì)化療藥物5-FU的敏感性,因此,認(rèn)為HT29細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU的耐藥性可以通過(guò)降低細(xì)胞自噬水平而得到減輕。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明RIP3能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的生長(zhǎng),提示RIP3調(diào)控的細(xì)胞自噬參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展,其研究結(jié)果可為進(jìn)一步了解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和結(jié)腸癌的臨床治療提供潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位單位】:廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位年份】:2018
【中圖分類】:R735.35
【部分圖文】:

自噬,信號(hào)通路,細(xì)胞


圖1細(xì)胞自噬信號(hào)通路圖逡逑Fig.l邋Autophagy邋signaling邋pathway逡逑越來(lái)越多的研究表明,細(xì)胞自噬與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及對(duì)抗腫瘤治療的反應(yīng)中逡逑有著直接或間接的聯(lián)系。細(xì)胞自噬與腫瘤的關(guān)系非常復(fù)雜,且仍部分存在爭(zhēng)議,逡逑目前認(rèn)為在腫瘤發(fā)生時(shí)細(xì)胞自噬起到抑制作用,但在腫瘤發(fā)展的進(jìn)程中,細(xì)胞自逡逑噬又可能為腫瘤細(xì)胞提供對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)缺乏和缺氧的機(jī)制,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[28]。逡逑細(xì)胞自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用,不能簡(jiǎn)單將其劃分逡逑為“有害”或“有益”的,研究表明自噬對(duì)于腫瘤的影響是分階段和有針對(duì)性的。逡逑細(xì)胞自噬缺陷,生物體某些自發(fā)性腫瘤的發(fā)生幾率增高。當(dāng)腫瘤發(fā)生后,自噬作逡逑用又可能為生活環(huán)境惡劣的腫瘤細(xì)胞提供有效的供養(yǎng)途徑。此外,細(xì)胞自噬在腫逡逑瘤細(xì)胞的抗癌藥物介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮不同作用,在不同腫瘤細(xì)胞和不同情況逡逑下細(xì)胞自噬可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡,也可能保護(hù)細(xì)胞使細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥作逡逑

過(guò)表達(dá),質(zhì)粒,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,自噬


用Western邋Blotting方法檢測(cè)RIP3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,逡逑RIP3邋shRNA組的RIP3表達(dá)量明顯降低,而Flag-RIP3組的RIP3表達(dá)量明顯升逡逑高(圖3.1A),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PC0.01或P<0.001),成功構(gòu)建出RIP3穩(wěn)逡逑定低表達(dá)和高表達(dá)的HT29突變細(xì)胞株。采用無(wú)糖培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,18小逡逑時(shí)后收集細(xì)胞提取總蛋白,用Western邋Blotting方法檢測(cè)細(xì)胞自嗤流情況。結(jié)果逡逑顯示,與對(duì)照組相比,敲低RIP3后,細(xì)胞自噬流降低;而過(guò)表達(dá)RIP3后,細(xì)逡逑胞自噬流升高;并且在沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的情況下,RIP3低表達(dá)細(xì)胞的基礎(chǔ)白逡逑噬水平降低,RIP3過(guò)表達(dá)細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平升高(圖3.1B),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)逡逑意義(P<0.01)。因此,我們初步明確RIP3參與了葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的HT29細(xì)逡逑胞自噬,并且能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬。逡逑邐HT29邐邋HT29-shControl邋HT29-shRn)3邋HT29-Flag-RIP3逡逑Vector邋+邐'邐'邐*邐Complete邋Medium邋++--邋+邋+邋-邋?邋+邋+邋.-逡逑Flag-RIP3邐+逡逑C0?

免疫共沉淀,外源性,內(nèi)源性,相互作用


養(yǎng)液誘導(dǎo)HT29-Flag-RIP3細(xì)胞自嗤,采用免疫共沉淀的方法檢測(cè)RIP3是否與內(nèi)逡逑源性的GNAI3和RGS19相互作用。結(jié)果顯示,隨著細(xì)胞自噬的增強(qiáng),RIP3與逡逑GNAI3的作用增強(qiáng),與RGS19也有相互作用(圖3.3B),與前期質(zhì)譜結(jié)果相符。逡逑Flag-RGS19邐H邐1邐逡逑Myc-GNAI3邋—I—I邐1--1邐邋HT29-Fla£-RIP3逡逑Flag-RIP3邋邐1邐hH邐^邐No邋glucose邋Medium邋0邋6邐19邐24邋h逡逑Myc-RGS19邋邐1-邋+逡逑-邐lR邋r/1邐Flag-RIP3邋mm邋—?邋wm邋a*逡逑栜邋IB:邋Myc逡逑IP:邋Flag邐IP:Flag邋GNAI3邐W邋W逡逑**邐mm邐—?逡逑IB:邋Flag邐RGS19逡逑?邋?逡逑一^邋邐邋Flag-RIP3邐1逡逑—IB:邋MyC邐GNAI3邐i邐——逡逑Input邐—邐—■邐■邐,npUt邐LC3-II邐邐逡逑IB:邋Flag逡逑?邋^邐p_Actin逡逑A邐B逡逑圖3.3免疫共沉淀方法檢測(cè)RIP3是否與外源性(A)或內(nèi)源性(B)邋GNAI3和逡逑RGS19相互作用逡逑Fig.3.3邋Whether邋RIP3邋interacts邋with邋exogenous邋(A)邋or邋endogenous邋(B)邋GNAI3邋and逡逑RGS19邋by邋Co-IP逡逑3.邋2.邋3邋GNA13或RGS19的表達(dá)下調(diào)會(huì)抑制葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞自噬逡逑鑒于RIP3能夠與GNAI3和RGS19蛋白相互作用

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 萬(wàn)德森;;結(jié)直腸癌流行病學(xué)與預(yù)防[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志;2011年01期



本文編號(hào):2825502

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