【摘要】：乳腺癌是現(xiàn)今危害女性健康的主要原因之一,其機(jī)理復(fù)雜,迄今尚未明確。非編碼RNA(ncRNA)是表觀遺傳修飾的一種,其較編碼基因具有更廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制,是如今腫瘤機(jī)制研究的一個(gè)熱點(diǎn)話題。ncRNA根據(jù)其長(zhǎng)度有可分為短ncRNA和長(zhǎng)ncRNA(LncRNA)。LncRNAs表達(dá)水平比蛋白質(zhì)編碼基因低,但其表達(dá)具細(xì)胞/組織特異性,涉及多種生理和病理過(guò)程。本課題主要研究LncRNA在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用。本課題首先通過(guò)高通量測(cè)序,遴選在良性和惡性乳腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的LncRNAs,篩選出了尚未報(bào)道過(guò)的LncNONHSAT028712(簡(jiǎn)稱Lnc712)。并且通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了這一基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于人非致瘤性細(xì)胞。隨后通過(guò)轉(zhuǎn)染LncRNA Smart Silencer干擾以及流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法分析了Lnc712在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染LncRNA Smart Silencer敲低Lnc712的表達(dá)后,乳腺癌細(xì)胞的存活率下降,并且細(xì)胞停滯在G1期,而不進(jìn)入S期,導(dǎo)致細(xì)胞周期被破壞,細(xì)胞的增殖受到限制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨后顯示細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK2)在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均隨Lnc712的敲低而降低,提示Lnc712可以通過(guò)調(diào)節(jié)CDK2的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程�；谏鲜龅耐普�,進(jìn)一步研究了Lnc712調(diào)控CDK2的機(jī)制。首先用RNA pull down實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)分析并篩選出了與Lnc712直接結(jié)合的蛋白HSP90,并通過(guò)蛋白免疫印跡再次驗(yàn)證了兩者之間的結(jié)合。隨后熒光定量PCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CDK2在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均隨HSP90的敲低而降低,說(shuō)明HSP90可以調(diào)控CDK2的表達(dá)。通過(guò)查閱已有的文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn),HSP90與Cdc37形成的復(fù)合物HSP90/Cdc37可以調(diào)節(jié)下游CDK2的穩(wěn)定性。免疫共沉淀結(jié)果顯示,在乳腺癌細(xì)胞中沉默Lnc712表達(dá)后,HSP90與Cdc37的結(jié)合被破壞。提示Lnc712可能通過(guò)破壞HSP90/Cdc37復(fù)合物的形成調(diào)節(jié)CDK2的表達(dá)。綜上所述,本課題首先篩選出了在乳腺癌細(xì)胞中異常高表達(dá)的Lnc712,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)又驗(yàn)證了Lnc712可以通過(guò)調(diào)控HSP90與其輔助分子伴侶Cdc37的結(jié)合,調(diào)節(jié)下游CDK2的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞周期,影響乳腺癌細(xì)胞的增殖。因?yàn)榧?xì)胞的無(wú)限制增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素,所以本課題的發(fā)現(xiàn)有望為尋找腫瘤治療的新靶點(diǎn)提供可能方向,值得進(jìn)一步的研究和探索。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9
【圖文】：

細(xì)胞周期能否順利啟動(dòng)的關(guān)鍵點(diǎn)在于 G1 期，細(xì)胞能否殖的關(guān)鍵點(diǎn)。G1 期相關(guān)調(diào)節(jié)因子有 CyclinD、CyclinE、CD 聚集出現(xiàn)在 G1 晚期，與 CDK4 相結(jié)合，形成 CyclinD/C合位點(diǎn)附近的一個(gè)保守蘇氨酸被磷酸化后，其酶活性達(dá)到 G高點(diǎn)時(shí)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）磷酸化，然后釋放與E2F 進(jìn)而促進(jìn) CyclinE 與 CDK2 結(jié)合成 CyclinE/CDK合物經(jīng)過(guò)磷酸化修飾后，又可反過(guò)來(lái)抑制 pRb 的表達(dá)，進(jìn)一 DHFR、polⅡ等多種與 DNA 復(fù)制相關(guān)的基因表達(dá)，使細(xì)進(jìn)入 S 期后，CyclinE 被泛素化降解，CDK2 隨后又與 CyA 的復(fù)制。G2 期主要由 CDK1 先后形成的復(fù)合物 Cycli行調(diào)節(jié)，其中起主要作用的是 CyclinB/CDK1，它與細(xì)胞成被稱為成熟促進(jìn)因子(MPF)，MPF 可通過(guò)磷酸化修飾多種與如核層連蛋白、組蛋白、微管蛋白等。M 期是細(xì)胞周期中的末期被泛素化降解，有絲分裂終止[51, 53-56]。

圖 1-2 HSP90 構(gòu)象循環(huán)Fig.1-2 HSP90 conformation cycle輔助分子伴侶相互作用，一同維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。HSP90，然后允許具有酶活性的其他輔助分子伴侶折疊或修復(fù)輔助分子伴侶分為兩類：一類是通過(guò)四分體肽（TPR）結(jié)為不需要 TPR 結(jié)構(gòu)域而與 HSP90 結(jié)合的。大部分為第P90 中發(fā)現(xiàn)的 MEEVD 基序以及 Hsp70 中的 EEVD 基序[70-相互作用蛋白（CHIP），Hsp70-相互作用蛋白（HIP），，蛋白磷酸酶 5（PP5）和幾種具有肽基-脯氨酰異構(gòu)酶（FK506 結(jié)合蛋白，肽基脯氨酰異構(gòu)酶 D（PPID）/親環(huán)蛋白 Tom7046 等[71]。不需要 TPR 結(jié)構(gòu)域即可與 HSP90 結(jié)合CDC37），HSP90 ATPase（Aha）1 和 p23 的激活劑[88,HSP90 ATP 酶活性，影響下游蛋白的新陳代謝。因此，藥物靶標(biāo)[90]。大量研究表明在不同核苷酸和輔助伴侶存在構(gòu)象也不相同。研究人員根據(jù)大量研究數(shù)據(jù)提出了 HSP9

第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 Lnc712 在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)1 微陣列分析篩選乳腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的 LncRNAs對(duì)良性乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7/WT 和惡性乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7/ADM 進(jìn)行表達(dá)列分析（包括編碼、非編碼 RNA），分析 LncRNAs 在這兩株細(xì)胞中的表達(dá)情出在這兩株細(xì)胞中表達(dá)有差異的 LncRNAs。分析結(jié)果如圖 3-1 所示，圖 A 中表示在兩株細(xì)胞中表達(dá)具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因。圖 B 中紅色的表示表達(dá)量高的基的表示表達(dá)量較低的。通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在 MCF-7/ADM 細(xì)胞中，有ncRNA 和未標(biāo)注的轉(zhuǎn)錄物上調(diào)，3708 個(gè)下調(diào)（圖 3-1 A），而有 3423 個(gè) mRN2950 個(gè)下調(diào)（圖 3-1 B，倍數(shù)變化≥ 2，P < 0.05）。在這 4030 個(gè)基因中，Lnc712 在兩株細(xì)胞中的差異性是較為顯著的，該基F-7/ADM 中高表達(dá)，在 MCF-7/WT 中低表達(dá)，說(shuō)明 Lnc712 在乳腺癌惡性腫瘤表達(dá)相較于良性乳腺癌細(xì)胞中高。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2818546