發(fā)布時間：2020-09-10 08:22

　　 研究背景:三氧化二砷是治療急性早幼粒細胞白血病的常用藥物,但是其對實體腫瘤的治療一直受限于高劑量所致的毒副作用以及腫瘤細胞的化療藥物抵抗作用。作者團隊發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對三氧化二砷藥物增敏效果顯著高于吉西他濱、5-FU、索拉菲尼等幾種膽管癌常用藥物。肝內(nèi)膽管癌是肝臟的第二大惡性腫瘤,患者預后極差,化療敏感性低,如何找到低毒有效的治療藥物,是當前臨床醫(yī)生所面臨的棘手難題。此外,三氧化二砷常引起一些較為嚴重的治療副反應,如肝毒性、皮膚病、神經(jīng)毒性、腎毒性和心臟毒性等,常常限制了三氧化二砷的臨床應用。肝臟是三氧化二砷作用的主要器官,三氧化二砷可通過誘導ROS產(chǎn)生,損傷肝細胞。此外,二甲雙胍通過抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ產(chǎn)生的少量內(nèi)源性的ROS可以延長線蟲的壽命,其機制可能與二甲雙胍間接誘導產(chǎn)生的過氧化物酶PRDX-2有關(guān)。研究目的:1.探索二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷對肝內(nèi)膽管癌的抑制作用。2.探索二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷對肝內(nèi)膽管癌的抑制作用的分子機制。3.探索二甲雙胍對三氧化二砷引起的肝細胞損傷的保護作用。研究方法:1.通過細胞活性試驗、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、細胞周期、細胞內(nèi)活性氧水平和裸鼠移植瘤抑制試驗等,在細胞和動物水平,證明二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷對肝內(nèi)膽管癌細胞的增殖抑制作用,并計算兩藥抑制腫瘤細胞的協(xié)同系數(shù)。2.我們用western blot技術(shù)檢測了二甲雙胍和三氧化二砷處理后肝內(nèi)膽管細胞癌內(nèi)AMPK、p38MAPK、ERK3和mTOR通路的變化;細胞水平上,我們通過基因沉默、過表達及激酶抑制劑和激活劑的手段先后分別下調(diào)和上調(diào)AMPK、p38MAPK及ERK3蛋白的表達或活性,檢測二甲雙胍和三氧化二砷處理后膽管癌細胞的功能學及相關(guān)蛋白的表達變化;在73例肝內(nèi)膽管癌患者腫瘤組織中檢測了ERK3蛋白的表達水平,分析其與患者臨床病理指標及預后的關(guān)系。3.用小鼠正常肝細胞AML12和昆明小鼠構(gòu)建三氧化二砷肝損傷的細胞和小鼠模型。檢測細胞凋亡、死亡和細胞內(nèi)活性氧水平;檢測肝臟組織學變化、肝酶、細胞凋亡等指標;基因芯片檢測二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷處理后AML12細胞基因表達譜變化,seahorse系統(tǒng)檢測細胞糖代謝變化。低糖或魚藤酮處理AML12細胞后,檢測細胞凋亡、死亡和細胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果1.二甲雙胍和三氧化二砷協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌細胞增殖;二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷有效抑制肝內(nèi)膽管癌細胞裸鼠移植瘤增殖。2.二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷可能通過抑制mTORCl的活性來抑制膽管細胞癌增殖。二甲雙胍可抑制三氧化二砷引起的p38MAPK的活化,下調(diào)或者抑制p38MAPK可以增強二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷抑制肝內(nèi)膽管癌細胞的作用,二甲雙胍和三氧化二砷能通過激活AMPK上調(diào)ERK3蛋白的表達,ERK3可以抑制mTORC1的活化。激活AMPK可抑制p38MAPK,上調(diào)ERK3表達。腫瘤組織中ERK3蛋白低表達是肝內(nèi)膽管癌患者預后的獨立危險因素。3.二甲雙胍抑制三氧化二砷誘導的AML12細胞凋亡,減輕三氧化二砷引起的小鼠肝損傷。調(diào)控葡萄糖代謝可能是二甲雙胍對三氧化二砷處理的AML12細胞的發(fā)揮保護作用的關(guān)鍵機制。低糖處理或魚藤酮可有效緩解三氧化二砷誘導AML12細胞凋亡性壞死。對線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的抑制作用介導了二甲雙胍對三氧化二砷誘導的AML12細胞凋亡性壞死的保護作用。二甲雙胍增加AML12細胞內(nèi)NADH/NAD+比例。結(jié)論1.二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷具有協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌的作用,該作用可能與兩藥可共同促進細胞周期阻滯于G0/G1期,促進細胞內(nèi)ROS升高,誘導肝內(nèi)膽管癌細胞凋亡有關(guān)。2.二甲雙胍和三氧化二砷可通過AMPK/p38 MAPK-ERK3/mTORC1通路在體內(nèi)和體外抑制肝內(nèi)膽管癌細胞增殖。腫瘤組織中ERK3蛋白低表達是肝內(nèi)膽管癌患者預后的獨立危險因素。p38MAPK的活性和E)RK3蛋白的表達可能與肝內(nèi)膽管癌細胞對二甲雙胍和三氧化二砷的敏感性有關(guān)。3.二甲雙胍可有效減輕三氧化二砷引起的肝細胞損傷,其可能通過抑制粒體呼吸鏈復合物Ⅰ,提高肝細胞內(nèi)NADH/NAD+比率,進而抑制三氧化二砷誘導的細胞內(nèi)ROS水平,抑制細胞凋亡性壞死。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.8
【部分圖文】：

３．１二甲雙胍和三氧化二砷協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌細胞增殖逡逑使用ＲＴＣＡ系統(tǒng)實時檢測細胞增殖，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍（１０邋ｍＭ）聯(lián)合三氧化二逡逑砷（３邋ｐｍｏｌ／Ｌ）較對照組和單藥組比，明顯抑制肝內(nèi)膽管癌細胞增殖（圖３．１Ａ）。逡逑ＣＣＫ－８檢測細胞藥物抑制細胞增殖，計算得到ＣＩ指數(shù)，當抑制率大于５０％，二甲逡逑雙胍聯(lián)合三氧化二砷在三種膽管癌細胞中，ＣＩ指數(shù)都小于１，即有協(xié)同抑制作用逡逑（圖邋３．１Ｂ，表邋２）。逡逑Ａ邋邐邐嚴＿＿Ｓ？Ｌ，Ｐ：１邋邐邐邐邋—邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ｂ邋，邐ＣＣＬＰ－１逡逑；；一＾山１邋丨１１１＾＾＾＊邐￣￣￣￣￣邋Ｓ＂，？一—，＊邐＃邋邐邐逡逑ｔ？邐？＊３邐Ｈｉ邐＊？邐Ｂｌ邐？Ｓ邐Ｕ：邐＊ＳＩ邐Ｕｌ邐Ｖｆｌ邐？邐Ｑ．２Ｓ邐ｆｔ｝邐０．７Ｓ邐Ｉ逡逑Ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｅｆｆｅｃｔ逡逑，邐ｔ邐ＲＢＥ逡逑ｉ邋？邐＾邐：逡逑ＩＳ邐？ｔ邐ＨＩ邐Ｘ：邐ｍｔ邐ｍ邐Ｅ：邐－ｒｉ邐Ｂ＞邐？？：邐Ｑ邐？？邐（Ｌｊ邐０．ＪＳ邐１逡逑Ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｅｆｆｅｃｔ逡逑ＨＣＣＣ－９８１０邐ＨＣＣＣ－９８１０逡逑ｔｔ邐ｍ邐ｎａ邐�。裕哼姡酰暨姡�？邐ｍｅ邐ｈｉ邐ｋ＞邐■＊邐３邐ｏ．ａ邐ｂｆｉ邐ａｎ邐１逡逑Ｔ￣＊＂ｔｏ＊＇邐Ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｅｆｆｅｃｔ逡逑圖３．１二甲雙胍和三氧化二砷協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌細胞增殖逡逑圖注：Ａ二f袼遙ǎ保埃恚停┝先躉椋ǎ辰校睿錚歟蹋┐砣指文詰ü苠義習┫赴罰殘∈

本文編號：2815599