【摘要】：研究背景和目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常見的造血系統(tǒng)腫瘤,增殖缺陷和分化受阻是導致白血病干細胞能過度增殖的兩大原因。至今為止,大部分AML患者的治療現(xiàn)狀也不容樂觀,即使能夠通過化療使病情完全緩解,復發(fā)的比率也仍然不容樂觀。雖然ATRA用于誘導分化治療AML取得了成功,但是ATRA誘導分化治療僅對占AML 10%的APL(M3型AML)有效,而且還存在維甲酸綜合征和維甲酸耐藥兩大缺陷,因此研究新的誘導分化劑也已經成為治療AML研究的迫切需要。酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTK)的異常激活在AML發(fā)病進程中發(fā)揮重要作用,以PTK為靶點的藥物研發(fā)和治療方案已成為研究熱點,許多酪氨酸蛋白激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)類抗腫瘤藥物被報道具有脫靶效應(off-target),具有一定的白血病治療作用。然而這些藥物自身誘導AML細胞分化活性較弱,但是能協(xié)同ATRA誘導AML細胞分化。Vibsane型二萜化合物是莢醚屬植物內提取的天然小分子化合物,存在80多種構型,具有魚毒活性,被廣泛報道具有抗腫瘤作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Vibsanin A是一種新型的誘導分化劑,能顯著誘導AML細胞分化,隨后發(fā)現(xiàn)并確證了蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是其誘導白血病細胞分化的作用靶點,Vibsanin A通過激活PKC依賴的ERK/MAPK途徑誘導AML細胞分化,研究還發(fā)現(xiàn)Vibsanin A能夠協(xié)同酪氨酸激酶抑制劑誘導AML細胞分化,本課題擬通過細胞分化模型篩選,發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑協(xié)同Vibsanin A誘導AML細胞分化的最佳組合;深入研究PTK和PKC及其介導的信號轉導通路,以期揭示酪氨酸激酶抑制聯(lián)合Vibsanin A誘導AML細胞分化的分子機制,最終為誘導分化治療AML提供新的治療方案和藥物靶點。研究方法1.利用流式細胞學檢測細胞表面分化抗原CD11b的方法,篩選出一類可能具有誘導AML細胞分化作用的TKIs,并分別評估這些化合物聯(lián)合Vibsanin A協(xié)同誘導AML細胞分化的活性。2.通過細胞形態(tài)學實驗、細胞增殖抑制實驗和細胞周期實驗和周期蛋白檢測進一步確定酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合Vibsanin A誘導AML細胞分化的協(xié)同作用。3.利用經典PKC激動劑作為陽性對照藥物,利用PKC信號分子抑制劑干預AML細胞分化,如GFX(PKC非選擇性抑制劑)及GO6983(傳統(tǒng)型和新型PKC抑制劑,抑制PKC-γ、ε、η、θ)等,觀察它們對酪氨酸激酶靶向抗腫瘤藥物聯(lián)合FTC誘導的白血病細胞分化的作用,驗證PKC途徑是否參與協(xié)同誘導AML細胞分化。4.本部分研究重點以PKC下游與白血病細胞分化相關的信號轉導通路如MAPK為主要研究對象,采用Western blot、免疫共沉淀等技術,觀察通路中關鍵性信號分子磷酸化水平變化的時空效應,確定參與誘導AML細胞分化的PKC下游信號分子,并分析PKC與酪氨酸激酶調控的相互作用關系(協(xié)同或拮抗關鍵信號分子的激活效應)。5.靶向沉默或過表達技術對協(xié)同誘導AML細胞分化的關鍵信號分子進行驗證。研究結果1.Vibsanin A聯(lián)合TKIs誘導AML細胞分化。通過細胞表面分化抗原流式細胞學檢測,我們發(fā)現(xiàn)一系列FDA批準于上市的TKIs在沒有明顯毒性的劑量下都能誘導HL-60細胞分化,大部分TKIs都能協(xié)同Vibsanin A誘導AML細胞分化,其中Imatinib和Sracatinib與Vibsanin A的協(xié)同作用最強。2.Vibsanin A能聯(lián)合TKIs誘導AML細胞生長抑制和周期阻滯。Vibsanin A聯(lián)合TKIs能夠誘導AML細胞G1期細胞增加從而顯著協(xié)同抑制細胞增殖。蛋白水平研究結果表明Vibsanin A能顯著的聯(lián)合TKIs上調周期蛋白P21和P27的表達,降低CDK4和CDK6的表達,并且抑制Rb蛋白的磷酸化。3.Vibsanin A聯(lián)合TKIs通過PKC途徑的激活誘導AML細胞分化。經典的PKC激動劑PMA與Vibsanin A有相似的協(xié)同TKIs誘導AML細胞分化的作用,廣譜PKC抑制劑能夠部分抑制TKIs聯(lián)合Vibsanin A或TKIs單獨誘導AML細胞分化。4.Vibsanin A聯(lián)合TKIs上調Lyn蛋白的表達,從而誘導AML細胞分化。Y416位點是SRC家族激酶通用的磷酸化位點,研究結果表明Vibsanin A能增強SRC家族激酶Y416位點磷酸化,而TKIs則抑制該位點的磷酸化,但是TKIs單獨均能均誘導SRC蛋白激酶家族中Lyn蛋白表達增加,并且與Vibsanin A上調Lyn蛋白表達的作用存在正向協(xié)同。對Lyn進行免疫沉淀后,發(fā)現(xiàn)Lyn的Y416位點磷酸化水平與其總蛋白的表達水平無關,為驗證Lyn蛋白的上調在誘導AML細胞分化中的關鍵作用,我們構建了靶向沉默Lyn的慢病毒,發(fā)現(xiàn)靶向干擾Lyn能夠抑制所有TKIs聯(lián)合Vibsanin A誘導AML細胞分化的作用,在靶向干擾Lyn的同時抑制PKC途徑則幾乎完全阻斷AML細胞分化。5.PKC和Lyn通過Raf/MEK/ERK信號通路聯(lián)合誘導AML細胞分化。Vibsanin A能聯(lián)合TKIs能增強ERK1/2、MEK、以及Raf-1的S338和S289/296/301位點的磷酸化的作用,并進一步抑制Raf活性抑制位點S259的磷酸化。Raf-1抑制劑Sorafenib和ERK1/2抑制劑U0126均能抑制聯(lián)合誘導AML細胞分化,抑制PKC途徑或者靶向沉默Lyn均能抑制Raf/MEK/ERK信號通路的激活。6.Vibsanin A聯(lián)合TKIs下調c-Myc蛋白的表達誘導AML細胞分化。Vibsanin A聯(lián)合TKIs用藥后1h,實時熒光定量和Western blot檢測到c-Myc蛋白在轉錄水平的下調和蛋白水平的降解,Raf-1抑制劑Sorafenib和ERK1/2抑制劑U0126能夠減弱Vibsanin A聯(lián)合TKIs誘導HL-60細胞內c-Myc蛋白下調的作用,阻斷PKC途徑和靶向沉默Lyn也能逆轉c-Myc蛋白的表達,最后,我們建立過表達c-Myc的AML細胞株,發(fā)現(xiàn)過表達c-Myc能拮抗TKIs聯(lián)合Vibsanin A誘導AML細胞分化的作用。研究結論1.研究發(fā)現(xiàn)天然小分子化合物Vibsanin A能夠增強TKIs誘導AML分化的作用。2.Vibsanin A聯(lián)合TKIs通過PKC途徑和Lyn途徑發(fā)揮協(xié)同誘導AML細胞分化的作用。3.Vibsanin A聯(lián)合TKIs通過激活PKC和上調Lyn蛋白表達協(xié)同激活ERK/MAPK信號通路,增強對c-Myc的抑制作用,從而上調周期蛋白的表達使AML細胞周期阻滯,并協(xié)誘導AML細胞分化。4.Vibsanin A聯(lián)合TKIs有望為AML或其他白血病治療提供新的誘導分化治療策略。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.7
【圖文】：

第一章 天然小分子化合物 Vibsanin A 聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑誘導AML 細胞分化效應研究本課題前期研究在國家“重大新藥創(chuàng)制”專項課題《天然活性成分 Vibsanin A靶向 PKC 誘導分化治療白血病的候選藥物研究》（課題編號：2009ZX09103-406；2009-2010）資助下從早禾樹樹葉中提取了大量的天然 Vibsanin 型二萜化合物，發(fā)現(xiàn)其中 Vibsanin A 是一個具有潛力的誘導分化劑(如下圖所示)，能夠誘導白血病細胞分化、抑制白血病細胞增殖，進而降低白血病細胞的成瘤性，發(fā)現(xiàn)并確證了蛋白激酶 C（PKC）是其誘導白血病細胞分化的作用靶點，分子機制研究結果揭示PKC/ERK通路參與Vibsanin A誘導的白血病細胞分化，表明小分子化合物VibsaninA 是一個有前景的靶向 PKC 誘導分化治療白血病的候選藥物。

圖 1.2 TKIs 誘導 HL-60 細胞分化活性篩選Imatinb(IMA)與 Saracatinib(SAR) (5、10、20μM)； Bosutinib(BOSU)（1.25、2.5、5 μM）；Dasatinib(DASA) 、Gefitinib(GEFI)、Erlotinib(ERLO)與 Nilotinib(NILO)（2.5、5、10μM）聯(lián)合誘導 HL-60 細胞 72h 后經流式細胞儀檢測 CD11b 的表達。圖中數(shù)據采用均值±標準差表示，n=3，各劑量藥物處理組與 DMSO 對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Student t檢驗分析數(shù)據顯著性差異。1.3.2 TKIs 協(xié)同 Vibsanin A 誘導 HL-60 細胞分化活性篩選天然小分子化合物 Vibsanin A0.1μM 劑量單獨誘導 HL-60 細胞 CD11b 表面標記的表達率為 13.3±1.9%，故采用該劑量（0.1μM）用于聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑誘導 AML 細胞分化研究（圖 1.3A）。流式細胞學檢測結果表明（圖 1.3B）：大部分酪氨酸激酶抑制劑均能聯(lián)合低劑量 Vibsanin A 顯著增強誘導急性髓系白血病細胞HL-60 的分化效應，其中 Saracatinib、Imatinib10μM 劑量下聯(lián)合 Vibsanin A0.1μM誘導HL-60細胞CD11b表達率分別從21.9%和29.5%提升至75.1%和87.3%；EGFR抑制劑 Erlotinib、Gefitinib 單獨幾乎不誘導 HL-60 細胞 CD11b 表達，聯(lián)合 VibsaninA 卻可將 CD11b 的表達率分別從 2.99%和 2.29%提高至 52.6 和 56.7%；Dasatinib

Dasatinib（5μM）和 Nilotinib（10μM）聯(lián)合 Vibsanin A (0.1 μM)誘導 HL-60 細胞分化 3d 后經流式細胞儀檢測 CD11b 的表達（B）。綜合評估各抑制劑增強 Vibsanin A 誘導 AML 細胞分化能力（C），圖中數(shù)據采用均值±標準差表示，n=3， *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 與對DMSO 對照組相比（Student t 檢驗）；## P < 0.01, ### P < 0.001 表示協(xié)同用藥組與兩個單獨用藥組相比同時具有統(tǒng)計學差異（one-way ANOVA），& P < 0.05 與 Vibsanin A 組相比（Studentt 檢驗）。1.3.3 Vibsanin A 協(xié)同 TKIs 誘導 HL-60 細胞分化的量效關系梯 度 濃 度 （ Imatinib 或 Saracatinib 聯(lián) 合 相 應 固 定 劑 量 比 的 Vibsanin A（Imatinib/Saracatinib: VibsaninA=100：1）處理 HL-60 細胞 72h，經流式細胞學檢測 CD11b 表達，并根據 Chou-Talalay 聯(lián)合指數(shù)法[32]，計算藥物聯(lián)用的 CI 值。結果表明 Imatinib（圖 1.4A、B）或 Saracatinib（圖 1.4C、D）聯(lián)合 VibsaninA 誘導 HL-60細胞 CD11b 表達的 CI 值均小于 1，具有顯著的正向協(xié)同誘導 AML 細胞分化的作用，當 Imatinib 或 Saracatinib 用藥劑量為 10μM，聯(lián)合 VibsaninA0.1μM 的情況下，CI 值均小于 0.01（分別為 0.009 和 0.002），表明在該劑量下，Imatinib 或 Saracatinib與 VibsaninA 具有極強的協(xié)同誘導分化作用。A B

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