發(fā)布時間：2020-07-22 14:03

【摘要】：研究背景:惡性腫瘤是威脅人類健康最主要疾病之一,其發(fā)病率呈逐年遞增趨勢,其中乳腺癌是為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,全球乳腺癌每年新發(fā)病例為 100多萬,其中死亡例數(shù)為40多萬。乳腺癌也是中國女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率也在逐年升高,因此乳腺癌在全球范圍內(nèi)被廣泛研究。雖然乳腺癌是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一,但因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)在還沒有特效的方法根治。深入研究其發(fā)病機(jī)制為臨床提供新的治療靶點(diǎn),成為亟待解決的問題。瞬時受體電位(transient receptor potential, TRP)通道絕大多數(shù)是一種陽離子非選擇性通道,由六次跨膜的α螺旋結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的N末端和C末端組成,并由第五第六跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成孔道區(qū)。TRP通道形成功能性同聚四聚體或異聚四聚體,在信號轉(zhuǎn)到中發(fā)揮作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)TRP通道家族和胃癌、前列腺癌、白血病及淋巴瘤等多種惡性腫瘤相關(guān)。TRPM7(transient receptor potential malestatin7)屬于LTRP亞族,同時具有蛋白激酶結(jié)構(gòu)和陽離子通道結(jié)構(gòu)。有文獻(xiàn)報道TRPM7在肺癌、膀胱癌以及乳腺癌中存在高表達(dá),并與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。近年來的研究表明,包括乳腺癌在內(nèi)的腫瘤組織內(nèi)存在一小部分致瘤能力特別強(qiáng),分化程度極低的細(xì)胞,具有干細(xì)胞的自我更新及多向分化特性,稱為“腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)”。腫瘤干細(xì)胞在啟動腫瘤形成和生長中發(fā)揮著決定性的作用,是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥的根源。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都表明,乳腺腫瘤干細(xì)胞對放化療都有抗藥性。傳統(tǒng)的腫瘤治療針對的是普通腫瘤細(xì)胞,卻無法從根本上消滅腫瘤干細(xì)胞,治療后腫瘤干細(xì)胞重新形成腫瘤組織并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。更有效的腫瘤治療需要在清除普通腫瘤細(xì)胞的同時也清除腫瘤干細(xì)胞。因而新的治療手段和新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)迫在眉睫,是近年來惡性腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。TRPM7是否在乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程中發(fā)揮重要功能,是否對乳腺癌干細(xì)胞有調(diào)控作用,從而影響乳腺癌對化療藥物的耐受,還未見文獻(xiàn)報道。目的:研究TRPM7對乳腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移、侵襲等功能的影響,并探討可能的調(diào)控機(jī)制。方法:本研究采用 QPCR、Western blot、免疫組化驗(yàn)證 TRPM7 在乳腺癌組織以及乳腺癌細(xì)胞的mRNA 和蛋白表達(dá)。施加特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA和TRPM7非特異性離子通道抑制劑2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-APB)處理細(xì)胞,利用MTT、transwell以及劃痕愈合等實(shí)驗(yàn)研究TRPM7對乳腺癌細(xì)胞的功能影響。流式細(xì)胞術(shù)用于檢測細(xì)胞周期以及乳腺腫瘤干細(xì)胞的變化。Western blot用于檢測相關(guān)信號通路的改變。比較兩種抑制劑作用后相關(guān)功能及信號通路變化,明確TRPM7雙活性蛋白的具體功能差異。結(jié)果: 1、TRPM7在乳腺癌組織中高表達(dá),TRPM7在化療后乳腺癌組織中表達(dá)升高,并且TRPM7的高表達(dá)與乳腺癌病人較差的預(yù)后有相關(guān)性。收集乳腺癌組織標(biāo)本,使用免疫組化檢測乳腺癌組織及其相對應(yīng)癌旁正常組織中TRPM7的表達(dá),發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中表達(dá)高于癌旁正常組織,QPCR結(jié)果顯示乳腺癌組織TRPM7的mRNA高于癌旁正常組織;QPCR檢測同一患者化療前后乳腺癌組織中TRPM7 的mRNA表達(dá),顯示化療后乳腺癌組織TRPM7的mRNA表達(dá)高于化療前。同時進(jìn)一步檢索數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),高表達(dá)TRPM7的乳腺癌患者總體生存情況差。 2、抑制TRPM7蛋白表達(dá)能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。使用慢病毒轉(zhuǎn)染體系建立穩(wěn)定抑制TRPM7蛋白表達(dá)(特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA)的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系和乳腺癌MCF7細(xì)胞系。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力,但無明顯抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞的增殖能力;劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)以及transwell小室實(shí)驗(yàn)分別顯示特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力。 3、特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加以及MET過程。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后細(xì)胞出現(xiàn)了G1期阻滯以及出現(xiàn)凋亡增加,從而影響了增殖能力。 Western blotting結(jié)果顯示,vimentin表達(dá)降低,E-cadherin表達(dá)升高,出現(xiàn)了典型的EMT過程,從而降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。 4、TRPM7在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞干細(xì)胞中高表達(dá),特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞會下調(diào)乳腺癌干細(xì)胞比例,從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。使用ALDEFLUOR檢測分選乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的干細(xì)胞,并對其進(jìn)行QPCR檢測,發(fā)現(xiàn)TRPM7在ALDH+乳腺癌干細(xì)胞亞群中mRNA表達(dá)升高;同時結(jié)果顯示特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA能夠降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中ALDH+乳腺癌干細(xì)胞的比例。施加紫杉醇化療藥物處理,發(fā)現(xiàn)特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)的shRNA抑制組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞呈現(xiàn)出較高的化療敏感性,另外相比對照組,抑制組化療后的ALDH+腫瘤干細(xì)胞比例明顯下降。 5、特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)著影響STAT3和AKT信號通路。使用Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)主要信號通路的磷酸化情況,結(jié)果顯示特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)顯著降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞 STAT3和AKT的磷酸化水平。推測TRPM7可能通過這兩條信號通路調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞。 6、抑制TRPM7離子通道活性能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,周期阻滯、凋亡增加以及下調(diào)乳腺腫瘤干細(xì)胞比例,但只影響AKT信號通路。使用TRPM7非特異性離子通道抑制劑2-APB處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,重復(fù)之前的功能實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示抑制TRPM7離子通道活性能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,周期阻滯、凋亡增加以及下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞干細(xì)胞比例,趨勢與特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)結(jié)果一致,但除了增殖抑制,其余程度均不如特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)。信號通路方面則僅抑制AKT通路,可能對STAT3無作用。結(jié)論:(1)TRPM7在乳腺癌中高表達(dá),與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后有顯著相關(guān)性;(2)特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)能夠通過下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞干細(xì)胞比例、發(fā)生G1期阻滯、發(fā)生MET過程及降低磷酸化STAT3和磷酸化AKT蛋白水平從而抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力;(3)特異性抑制TRPM7蛋白表達(dá)能夠下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的干細(xì)胞比例,并增強(qiáng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對紫杉醇的敏感性;(4)TRPM7主要通過STAT3和AKT信號通路發(fā)揮功能;(5)TRPM7離子通道活性參與大部分乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),但只影響AKT通路,STAT3通路可能只受激酶活性調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

癌[37]、食管癌[38]、鼻咽癌[39]、胰腺癌[40]且和相關(guān)惡性腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移正相關(guān)報道，乳腺癌化療前后組織中 TRPM7 的表達(dá)尚未RPM7 在乳腺癌組織中高表達(dá)，TRPM7 在乳腺癌化NA 在乳腺癌組織表達(dá)高于癌旁正常組織 M7 在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，收集了 16 例乳旁正常組織，使用熒光定量 PCR 分析在乳腺癌M7 的 mRNA 的表達(dá)量：使用 Trizol 提取總 mRNA顯示，乳腺癌組織中 TRPM7 的 mRNA 表達(dá)量高于

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文PM7 的 mRNA 在乳腺癌化療后組織表達(dá)高于乳腺癌化療前組了解 TRPM7 在乳腺癌組織化療前后的表達(dá)情況，收集了 8 例乳腺癌組織，使用熒光定量 PCR 檢測在乳腺癌病人化療前后的乳腺癌的表達(dá)量：使用 Trizol 提取總 mRNA 后進(jìn)行了熒光定量 PCR 檢測。乳腺癌組織中 TRPM7 的 mRNA 表達(dá)量明顯高于化療前（圖 2）。這一發(fā)生過程中可能扮演著重要角色，并且隨著乳腺癌化療而表達(dá)升高的化療耐藥有一定相關(guān)性。

38 圖 3：乳腺癌組織中 TRPM7 蛋白表達(dá)高于癌旁正常組織。 N 代表癌旁正常組織，M 代表乳腺癌癌組織，28 及 25 為組織編號 Fig 3： TRPM7 protein expresses higher in breast cancer tissues than paratumor normal tissues. N instead for paratumor normal tissues, M instead for cancer tissues. indicates statistical significance . 3.2 TRPM7 表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后情況相關(guān)性分析基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果及 TRPM7 與多種惡性腫瘤的相關(guān)性，推測 TRPM7 與乳腺癌患者的預(yù)后間存在一定的相關(guān)性，于是在 The Cancer Genome Atlas（TCGA）中檢索 TRPM7 與患

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