【摘要】：研究背景與目的肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類健康和生命。肺癌不僅發(fā)病率和死亡率高,而且惡性轉(zhuǎn)移高,預(yù)后較差。因此,尋找肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物以及靶向治療的靶點(diǎn)是治療肺癌的新策略。半乳糖凝集素-4(galectin-4)是半乳糖凝集素家族中的一個(gè)串聯(lián)重復(fù)型成員,擁有兩個(gè)相似的糖識別域(carbohydrate cognition domain,CRD)。Galectin-4 在細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞表面及循環(huán)中都有表達(dá),可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及黏附。已有研究表明在結(jié)直腸癌和胰腺癌中g(shù)alectin-4參與調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程,在肺腺癌中,galectin-4的高水平表達(dá)是轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測因子,與臨床不良預(yù)后有關(guān)。然而galectin-4在肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本課題擬揭示在肺腺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中g(shù)alectin¨4與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系,并探討潛在的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果實(shí)驗(yàn)方法:1.檢測細(xì)胞內(nèi)galectin-4對肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力以及與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響本論文選用了高表達(dá)galectin-4的肺腺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞作為研究對象,首先采用siRNA技術(shù)干擾A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞內(nèi)galectin-4的表達(dá),采用Western blot方法檢測galectin¨4的表達(dá)情況。干擾細(xì)胞內(nèi)galectin-4后,采用劃痕實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測galectin-4對A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的黏附、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。2.檢測galectin-4對黏附分子以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用為探究galectin-4調(diào)控肺腺癌細(xì)胞粘附、侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制,采用Western blot方法檢測siRNA干擾galectin-4表達(dá)后A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞內(nèi)黏附分子E-cadherin、N-cadherin、ICAM-1 和 CD44,侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白 EGFR、MMP-2和p-FAK表達(dá)的變化。為進(jìn)一步揭示galectin-4是如何調(diào)控這些蛋白的表達(dá),檢測了 galectin-4對轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、NF-κB、p-STAT3表達(dá)的影響,同時(shí)使用p-STAT3抑制劑HO-3867和NF-κB抑制劑PDTC來研究NF-κB和p-STAT3二者在信號通路中的上下游關(guān)系。3.確定galectin-4調(diào)控肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制NF-κB和β-catenin是兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,為探究兩者對肺腺癌細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin、CD44 和 MMP-2 的調(diào)節(jié)作用,采用 NF-κB 抑制劑 PDTC和β-catenin抑制劑ICG-001后檢測上述蛋白的表達(dá)水平。同時(shí),采用NF-κB抑制劑PDTC和β-catenin抑制劑ICG-001以及galectin-4 siRNA處理細(xì)胞后,通過劃痕實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB和β-catenin在galectin-4調(diào)控肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,再通過Western blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證二者對galectin-4調(diào)控細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.細(xì)胞內(nèi)galectin-4影響肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力以及與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附Western blot結(jié)果顯示,干擾galectin-4能降低A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞內(nèi)galectin-4的表達(dá)。劃痕實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干擾galectin-4之后,A549細(xì)胞遷移速度加快,侵襲能力增強(qiáng),對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的黏附能力增強(qiáng)。干擾galectin-4之后,H1299細(xì)胞遷移受到抑制,侵襲能力減。弱,對HUVECs的黏附能力減弱。說明細(xì)胞內(nèi)galectin-4抑制A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,促進(jìn)H1299細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。2.Galectin-4調(diào)節(jié)黏附分子以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果表明,在A549細(xì)胞中,干擾galectin-4后,黏附分子E-cadherin的表達(dá)量減少,N-cadherin和CD44表達(dá)量增加,即galectin-4能通過調(diào)控黏附分子E-cadherin、N-cadherin和CD44來抑制A549細(xì)胞的黏附。在H1299細(xì)胞中,干擾galectin-4后,黏附分子N-cadherin和CD44表達(dá)量減少,干擾前后細(xì)胞內(nèi)E-cadherin均不表達(dá)。說明galectin-4能通過上調(diào)N-cadherin和CD44來促進(jìn)H1299細(xì)胞的黏附。在A549細(xì)胞中,galectin-4還能下調(diào)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá),在H1299細(xì)胞中,galectin-4能上調(diào)MMP-2和EGFR的表達(dá)。說明EGFR和MMP-2同樣參與galectin-4調(diào)控的侵襲轉(zhuǎn)移過程。在兩種細(xì)胞中,galectin-4并不調(diào)控ICAM-1和p-FAK蛋白的表達(dá)。此外,我們發(fā)現(xiàn)galectin¨4影響轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、NF-κB、p-STAT3的表達(dá)。黏附分子和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白可能受這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。對NF-κB和p-STAT3在信號通路中的上下游調(diào)控關(guān)系研究結(jié)果顯示,加入p-STAT3抑制劑HO-3867能顯著抑制NF-κB的表達(dá),而加入NF-κB抑制劑PDTC對p-STAT3的表達(dá)沒有影響。這說明NF-κB受p-STAT3調(diào)控,但不調(diào)控p-STAT3,即NF-κB位于p-STAT3的下游。3.Galectin-4調(diào)控肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制加入 NF-κB 和β-catenin 抑制劑后,E-cadherin、N-cadherin、CD44 和 MMP-2的表達(dá)發(fā)生變化,表明 NF-κB 和β-catenin 調(diào)控 E-cadherin、N-cadherin、CD44和MMP-2的表達(dá)。因此我們推測,galectin-4是通過p-STAT3/NF-κB和β-catenin調(diào)控E-cadherin、N-cadherin、CD44和MMP-2的表達(dá)來影響細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。劃痕實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在PDTC和ICG-001存在的情況下,肺腺癌細(xì)胞的遷移、黏附和侵襲均受到抑制。即galectin-4是通過調(diào)控NF-κB和β-catenin來影響肺腺癌細(xì)胞的黏附、侵襲轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示,galectin-4是通過調(diào)控NF-κB和β-catenin來調(diào)節(jié)E-cadherin、N-cadherin、CD44和MMP-2的表達(dá)。綜上,galectin-4通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子p-STAT3/NF-κB 和β-catenin 調(diào)控 E-cadherin、N-cadherin、CD44 和 MMP-2 的表達(dá),從而影響肺腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)論1.細(xì)胞內(nèi)galectin-4抑制A549細(xì)胞遷移、黏附和侵襲,促進(jìn)H1299細(xì)胞遷移、黏附和侵襲。2.在 A549 細(xì)胞中,galectin-4 通過下調(diào)β-catenin 減少 N-cadherin、CD44 和 MMP-2的表達(dá),增加E-cadherin的表達(dá),下調(diào)p-STAT3/NF-κB減少N-cadherin和CD44的表達(dá)來抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。在H1299細(xì)胞中,galectin-4通過上調(diào)β-catenin和p-STAT3/NF-κB增加N-cadherin、CD44和MMP-2的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。兩條通路中,β-catenin的作用優(yōu)于p-STAT3/NF-KB。3.在H1299細(xì)胞中,galectin-4能上調(diào)EGFR的表達(dá),但不促進(jìn)EGFR進(jìn)入胞漿。而在A549細(xì)胞中,galectin-4并不能影響EGFR的表達(dá),EGFR可能是兩種細(xì)胞中g(shù)alectin-4發(fā)揮相反作用的一個(gè)重要調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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本文編號：2765802