【摘要】：肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率男性多于女性,根據(jù)最新統(tǒng)計,在全世界發(fā)展中國家的男性中,肝癌是癌癥死亡的第二大原因,在發(fā)達國家的男性中,排名癌癥死亡的第六位。據(jù)統(tǒng)計,在2012年期間全世界大約有78.25萬新增肝癌病例,因肝癌死亡的人數(shù)大約74.55萬例,而我國就占了新增病例及死亡病例總數(shù)的50%。肝細胞癌是肝癌的主要類型,占肝癌的70-90%。然而肝細胞癌形成和發(fā)展的具體機制仍不清楚,缺乏有效治療方法。目前手術切除仍是治療肝細胞癌的首選方法,然而根治性切除后患者的5年復發(fā)率高、轉移率高,這成為肝細胞癌臨床治療的難題。因此,從分子水平研究肝細胞癌的發(fā)生機制,并針對此尋找有效的治療措施成為當今肝細胞癌研究中的重點和難點。REC8是構成染色體結構維持蛋白復合體黏著素中的一員。黏著素在細胞有絲分裂及減數(shù)分裂中發(fā)揮調整染色體分離和同源重組的作用,參與DNA損傷修復,在真核細胞增殖過程中起著至關重要的作用。染色體的正確分離對于細胞的增殖非常重要,染色體的分離異常與多種疾病相關,尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。同時黏著素在轉錄過程中可以與DNA結合調控增強子與啟動子的相互作用。能夠參與多種基因的表達調控,如原癌基因、癌基因的表達調控,同時與CCCTC-結合因子(CCCTCbinding factor,CTCF)共定位于染色體,通過CTCF的作用調控轉錄,因此黏著素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。REC8是黏著素家族中新近發(fā)現(xiàn)的一員,它屬于黏著素減數(shù)分裂特異亞基,進入減數(shù)分裂Ⅰ期,RAD21被減數(shù)分裂特異的黏著素亞基REC8取代。同時REC8是腫瘤/睪丸(Cancer/Testis,CT)基因的一員,這類基因生理狀態(tài)下在生殖細胞系高表達,在癌癥中被異常激活,它們在癌癥細胞生理學的作用仍有待闡明。近期研究發(fā)現(xiàn)在胃腸間質瘤中出現(xiàn)REC8的異常甲基化,在多倍體腫瘤細胞中表達異常,在胃癌、甲狀腺癌中表現(xiàn)出抑癌作用。目前,國內(nèi)外尚未見到有關REC8在肝細胞癌中的表達及其作用機制的研究報道。本研究觀察REC8在人類肝細胞癌組織及肝癌細胞系的表達,研究其對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管形成等生物學行為的影響,并探討它在肝癌細胞中的作用機制,為肝細胞癌提供新的治療靶點。第一部分:REC8在肝細胞癌組織及肝癌細胞中的表達目的:觀察REC8在肝細胞癌組織及癌旁組織中的表達情況,以及REC8在肝癌細胞系和肝細胞系的表達情況。方法:收集河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院肝膽外科2015年1月-2016年12月行手術切除并經(jīng)術后病理證實為肝細胞癌患者40例。實驗標本共80例,包括新鮮肝細胞癌組織標本40例及相應癌旁組織40例。應用免疫組織化學染色法、Real-time PCR、蛋白質免疫印跡法檢測REC8在肝細胞癌組織及相應癌旁組織的表達水平及特點,應用細胞免疫熒光染色分析、蛋白免疫印跡法檢測肝癌細胞以及肝細胞中的REC8的表達水平及特點。結果:1 REC8在肝癌組織中主要定位于細胞核,在癌旁組織中主要定位于細胞漿,在肝癌組織細胞核中表達較癌旁組織增高免疫組織化學染色結果REC8在肝細胞癌組織及癌旁組織中均有表達,但在肝細胞癌組織中REC8主要定位于細胞核,在癌旁組織中REC8主要定位于細胞漿,REC8在細胞核的表達明顯高于癌旁組織(P0.01)。Real-time PCR結果顯示在肝癌組織中REC8 m RNA的表達與癌旁組織沒有顯著差別(P0.05)。蛋白免疫印跡法結果顯示在肝癌組織中REC8在細胞核的表達水平高于癌旁組織(P0.01),提示REC8可能在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。2 REC8在肝癌細胞中主要表達于細胞核,在肝細胞中主要表達于細胞漿,在肝癌細胞系細胞核中表達較肝細胞增高細胞免疫熒光染色分析的結果表明在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞中REC8主要表達于細胞核,而在QSG-7701肝細胞中REC8在細胞核、細胞漿均有表達,主要表達于細胞漿。蛋白免疫印跡法實驗檢測肝癌細胞、肝細胞細胞核內(nèi)的REC8表達,當上樣蛋白總量為150μg時結果顯示三種肝癌細胞系中細胞核內(nèi)REC8的表達高于肝細胞(P0.05),提示REC8可能在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。第二部分:REC8對肝癌細胞生物學行為的影響目的:應用pcDNA3.1-Flag-REC8質粒轉染肝癌細胞建立REC8過表達肝癌細胞模型,觀察REC8對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移侵襲、血管生成能力等生物學行為的影響。方法:應用pcDNA3.1-Flag-REC8質粒分別轉染Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞(REC8組),以空載體(Control組)作為對照組,之后再利用蛋白免疫印跡檢測PCNA蛋白表達、細胞克隆形成實驗、CCK-8實驗觀察肝癌細胞增殖能力的變化;使用蛋白免疫印跡法檢測Cleaved-Caspase3蛋白表達、流式細胞儀Annexin V/PI雙染細胞凋亡觀察肝癌細胞凋亡的變化;應用蛋白免疫印跡法檢測MMP-9、Transwell侵襲實驗、細胞劃痕實驗觀察肝癌細胞遷移、侵襲能力的改變;應用蛋白免疫印跡法檢測VEGF-C、小管形成實驗觀察肝癌細胞對血管形成能力的改變。結果:1 pcDNA3.1-Flag-REC8質粒過表達REC8的效果鑒定應用pcDNA3.1-Flag-REC8質粒分別轉染Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞,以空載體作為對照組,轉染pcDNA3.1-Flag-REC8質粒后REC8的m RNA水平和蛋白水平均明顯上調(P0.01),證實pcDNA3.1-Flag-REC8質粒在三種肝癌細胞中均可成功過表達REC8。2過表達REC8抑制肝癌細胞的增殖蛋白免疫印跡法分析結果證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞中PCNA表達均下降(P0.01),表明在肝癌細胞系中,過表達REC8后,抑制肝癌細胞的增殖能力。細胞克隆形成實驗結果表明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞中細胞克隆形成數(shù)量減少(P0.01),表明過表達REC8后,肝癌細胞克隆形成受到抑制。CCK-8實驗結果表明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒24h、48h、72h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞增殖能力均下降(P0.05)。3過表達REC8促進肝癌細胞的凋亡蛋白免疫印跡法分析結果證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞中Cleaved-Caspase3表達均上升(P0.01),表明在肝癌細胞系中,過表達REC8促進肝癌細胞的凋亡。流式細胞儀Annexin V/PI雙染細胞凋亡檢測實驗證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞中細胞早期凋亡率升高(P0.01),表明過表達REC8促進肝癌細胞的凋亡。4過表達REC8促進肝癌細胞的遷移、侵襲蛋白免疫印跡法分析結果證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞中MMP-9表達均上調(P0.01),表明在肝癌細胞系中,過表達REC8增加肝癌細胞的遷移、侵襲能力。Transwell侵襲實驗結果證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞的侵襲能力增加,穿到Transwell小室下層的細胞數(shù)增加(P0.01),表明過表達REC8增加肝癌細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗侵襲實驗結果證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞的劃痕愈合能力增加(P0.01),表明過表達REC8增加肝癌細胞的遷移能力。5過表達REC8促進肝癌細胞的血管形成蛋白免疫印跡法分析結果證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞中VEGF-C表達均上調(P0.01),表明在肝癌細胞系中,過表達REC8增加肝癌細胞的血管生成能力。小管形成實驗結果證明,與Control組比較,轉染REC8過表達質粒48h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三種肝癌細胞對血管形成能力增加(P0.01),過表達REC8增加肝癌細胞的血管生成能力。第三部分:REC8通過PKA通路促進肝癌細胞的遷移侵襲及血管生成目的:通過免疫共沉淀聯(lián)合質譜分析篩選與REC8相互作用的靶蛋白,探討REC8促進肝癌細胞遷移侵襲及血管生成的作用機制。方法:通過免疫共沉淀以及細胞免疫熒光染色的方法驗證REC8與靶蛋白的相互作用。在過表達REC8后應用靶蛋白抑制劑干預肝癌細胞系并應用蛋白免疫印跡法檢測MMP-9、VEGF-C的表達、Transwell侵襲實驗、細胞劃痕實驗、小管形成實驗驗證其功能。結果:1在肝癌細胞中REC8與PKA RII-α存在相互作用通過免疫共沉淀聯(lián)合質譜分析后篩選與REC8相互作用的靶蛋白58個,其中PKA RII-α與細胞的遷移侵襲、血管形成關系密切。我們應用免疫共沉淀進行驗證,沉淀產(chǎn)物以PKA RII-α抗體進行蛋白免疫印跡法檢測時出現(xiàn)陽性結果,提示PKA RII-α與REC8可能存在相互作用。應用PKA RII-α抗體進行沉淀,沉淀產(chǎn)物以REC8抗體進行蛋白免疫印跡檢測出現(xiàn)陽性結果。我們進一步應用細胞免疫熒光染色檢測REC8與PKA RII-α是否存在相互作用,發(fā)現(xiàn)REC8染色定位于細胞核,PKA RII-α染色同時定位于細胞核,兩者間存在共定位,提示REC8與PKA RII-α存在相互作用。2在肝癌細胞中REC8通過與PKA RII-α作用使PKA活性升高蛋白免疫印跡法結果證明,過表達REC8后對PKA RII-α表達無明顯影響(P0.05)。PKA活性測定結果顯示,過表達REC8后PKA活性升高(P0.01),表明在肝癌細胞系中,REC8促進PKA活性上升。以上兩個結果提示REC8通過與PKA RII-α作用使PKA活性上升但不影響其表達。3 REC8通過PKA通路促進肝癌細胞的遷移侵襲蛋白免疫印跡法分析結果證明,過表達REC8后應用PKA抑制劑H89,肝癌細胞Hu H-7中MMP-9表達下降(P0.01),表明在肝癌細胞系中,REC8通過PKA通路上調MMP-9的表達,從而促進肝癌細胞的遷移侵襲。PKA抑制劑H89可抑制REC8過表達誘導的遷移、侵襲(P0.01)。Transwell侵襲實驗顯示REC8通過PKA通路影響肝癌細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗顯示REC8通過PKA通路影響肝癌細胞的遷移能力(P0.01)。4 REC8通過PKA通路促進肝癌細胞的血管生成蛋白免疫印跡法分析結果證明,過表達REC8后應用PKA抑制劑H89,肝癌細胞Hu H-7中VEGF-C表達下降(P0.01),表明在肝癌細胞系中,REC8通過PKA通路上調VEGF-C的表達,從而促進肝癌細胞的血管生成能力。小管形成實驗結果證明,過表達REC8后應用PKA抑制劑H89,肝癌細胞Hu H-7對血管形成能力減低,表明在肝癌細胞系中,REC8通過PKA通路促進肝癌細胞的血管生成。結論:1 REC8在肝細胞癌組織及肝癌細胞中主要表達于細胞核,在癌旁組織及肝細胞主要表達于細胞漿,提示REC8可能在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。2 REC8抑制肝癌細胞的增殖,促進其凋亡、遷移、侵襲和血管生成。3 REC8通過PKA通路促進肝癌細胞的遷移侵襲和血管生成。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7
【圖文】：

35附 圖圖1 組織標本經(jīng)HE染色證實為癌旁組織和肝細胞癌（放大倍數(shù)200倍）Fig.1 Hepatocellular carcinoma was confirmed by HE staining with a 200×magnification圖2免疫組織化學染色結果顯示在肝癌組織中REC8在細胞核的表達水平高于癌旁組織（代表圖片，放大倍數(shù) 400 倍）Fig.2 The results of immunohistochemical staining showed the expressionof REC8 in the nucleus in the HCC tissues was higher than in the normaladjacent tissues with a 400×magnification (representative pictures)

35圖2免疫組織化學染色結果顯示在肝癌組織中REC8在細胞核的表達水平高于癌旁組織（代表圖片，放大倍數(shù) 400 倍）Fig.2 The results of immunohistochemical staining showed the expressionof REC8 in the nucleus in the HCC tissues was higher than in the normaladjacent tissues with a 400×magnification (representative pictures)

組織中 REC8 mRNA 的表達與癌旁組織沒有mRNA expression of REC8 between normal adjand HCC tissues was no statistical significance

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