【摘要】：目的:宮頸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,不斷威脅著女性的生命健康。人乳頭瘤病毒16型(HPV16)被認(rèn)為是宮頸癌最主要的外源性致病因素,其中E6癌基因在抑制細(xì)胞凋亡,干擾染色體穩(wěn)定性,影響信號(hào)通路,以及免疫逃逸等方面起重要作用。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是上皮細(xì)胞間粘附連接的重要分子,該基因表達(dá)沉默會(huì)引起上皮細(xì)胞表型和侵襲能力的改變。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí),宮頸鱗癌組織中HPV16E6蛋白高表達(dá)與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化及E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。那么,HPV引起宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是否通過(guò)E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)節(jié)而致病仍有待研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建HPV16E6基因shRNA慢病毒載體,感染宮頸癌SiHa細(xì)胞,篩選建立穩(wěn)定細(xì)胞系,觀察基因沉默后E-cadherin表達(dá)及基因啟動(dòng)子甲基化的情況,觀察其細(xì)胞生物學(xué)功能。初步研究分析HPV16E6對(duì)E-cadherin基因高甲基化的作用機(jī)制,為宮頸癌的基因治療尋找有效靶點(diǎn)。方法1、培養(yǎng)宮頸癌SiHa細(xì)胞系,構(gòu)建HPV16E6基因shRNA慢病毒沉默載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞獲取陽(yáng)性克隆,進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序。將病毒載體共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞進(jìn)行包裝,測(cè)定病毒滴度,用嘌呤霉素篩選建立沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。2、設(shè)置shRNA E6沉默組、空載體組、空白對(duì)照組。RT-q PCR檢測(cè)HPV16E6、E-cadherin mRNA表達(dá)情況,Western Blot檢測(cè)HPV16E6基因沉默后蛋白表達(dá)情況,CCK-8法及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SiHa細(xì)胞增殖遷移能力,甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況。結(jié)果1、測(cè)序結(jié)果證明已成功構(gòu)建HPV16E6 shRNA慢病毒沉默質(zhì)粒,熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)綠色熒光,檢測(cè)包裝純化后的慢病毒滴度為5×108TU/ml,經(jīng)嘌呤霉素穩(wěn)篩后shRNA E6組HPV16E6 mRNA水平較另兩組明顯下降(P0.01),提示已成功篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。2、shRNA E6組的E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平較另兩組顯著上調(diào)(P0.01),而空載體組及空白組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時(shí)shRNA E6組SiHa細(xì)胞的增殖及遷移能力均較另兩組明顯減弱(P0.05)。3、shRNA E6組SiHa細(xì)胞中的E-cadherin基因非甲基化擴(kuò)增呈陽(yáng)性,甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物強(qiáng)度較空載體組及空白對(duì)照組明顯減弱,而空載體組及空白對(duì)照組SiHa細(xì)胞中的E-cadherin呈完全甲基化狀態(tài)。結(jié)論1、成功構(gòu)建的shRNA慢病毒沉默載體能夠有效沉默HPV16E6基因表達(dá)。2、沉默HPV16E6基因上調(diào)宮頸癌SiHa細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)水平,降低了SiHa細(xì)胞的增殖及遷移能力,同時(shí)下調(diào)E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平,該甲基化狀態(tài)的改變導(dǎo)致了E-cadherin重新表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2733311