【摘要】：【背景】在我國,膀胱癌(Bladder cancer,BC)發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之首。依據(jù)生長方式的不同,膀胱癌可以分為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),前者占初診膀胱癌患者的70%左右,主要采用經(jīng)尿道膀胱惡性腫瘤電切術(shù)(TURBT),5年生存率達90%,NMIBC患者術(shù)后易復發(fā)進展,約15%術(shù)后會進展為MIBC,患者預(yù)后變差;后者占30%左右,主要采用根治性膀胱切除術(shù),術(shù)后約50%發(fā)生轉(zhuǎn)移,發(fā)生轉(zhuǎn)移后5年生產(chǎn)率僅為5%。膀胱癌侵襲進展對人類健康造成很大的威脅,明確膀胱癌侵襲進展的機制,對改進膀胱癌現(xiàn)有治療和預(yù)后判斷具有重要作用。癌蛋白Gankyrin在眾多惡性腫瘤的形成中發(fā)揮促癌作用。Gankyrin最初在肝癌研究中被發(fā)現(xiàn),近來研究表明Gankyrin在結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、肺癌和食道癌等多種惡性腫瘤發(fā)揮促癌作用,且與腫瘤惡性程度有關(guān)。目前,Gankyrin在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用和分子機制尚未明確。我們前期對10例膀胱癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織進行轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)果顯示Gankyrin在膀胱癌組織中表達高于癌旁正常組織,根據(jù)膀胱癌經(jīng)典分子起源學說及最新膀胱癌組織高通量測序結(jié)果,P53信號通路與膀胱癌侵襲性高度相關(guān),而根據(jù)文獻檢索,Gankyrin為P53分子的上游調(diào)控分子,因此我們推測Gankyrin在膀胱癌的侵襲進展過程中發(fā)揮重要作用�！灸康摹垦芯縂ankyrin在膀胱癌中的表達情況,探討其在膀胱癌侵襲進展中的作用及機制,以期為膀胱癌靶向治療和預(yù)后判斷提供新依據(jù)。【材料和方法】1.對10對膀胱癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織進行轉(zhuǎn)錄組測序,根據(jù)膀胱癌發(fā)生分子機制假說及文獻報道,篩選出Gankyrin作為研究對象。2.提取90對膀胱癌組織及癌旁正常組織的RNA及20對膀胱癌組織及癌旁正常組織的總蛋白,分別通過qRT-PCR和western blot驗證Gankyrin在膀胱癌中的表達情況。3.通過公共數(shù)據(jù)庫Oncomine挖掘數(shù)據(jù),驗證Gankyrin在膀胱癌患者的腫瘤組織中存在高表達。4.通過免疫組化,對3例肌層浸潤性膀胱癌病理大切片行Gankyrin染色,分析腫瘤侵犯粘膜層、淺肌層、深肌層時的表達情況,研究其和膀胱癌侵襲性的關(guān)系;分析130例膀胱癌患者腫瘤組織中Gankyrin的表達量,探討其與膀胱癌臨床病理資料和預(yù)后的關(guān)系。5.通過western blot和qRT-PCR檢測Gankyrin在正常尿路上皮、2種非肌層浸潤性膀胱癌、2種肌層浸潤性膀胱癌細胞系中的表達量。6.利用慢病毒載體構(gòu)建Gankyrin穩(wěn)定過表達的BIU87細胞系和Gankyrin穩(wěn)定敲減的UMUC3細胞系,通過EdU細胞增殖試驗和NOD/SCID小鼠的皮下成瘤實驗,研究Gankyrin過表達和敲低對膀胱癌細胞增殖、成瘤能力的影響。通過細胞劃痕實驗和Transwell小室遷移侵襲實驗,檢測Gankyrin對膀胱癌細胞遷移和侵襲能力的影響。通過流式細胞術(shù)檢測Gankyrin對膀胱癌細胞凋亡的影響。7.利用BBN誘導小鼠自發(fā)產(chǎn)生膀胱癌,通過免疫組化檢測Gankyrin在小鼠自發(fā)膀胱癌模型中的表達情況并探討其意義。8.通過連續(xù)切片免疫組化染色,分析32例膀胱癌組織中Gankyrin和MDM2表達的相關(guān)性,利用western blot檢測Gankyrin過表達和敲低后MDM2的表達水平,通過免疫熒光檢測Gankyrin和MDM2在膀胱癌中的亞細胞定位,利用蛋白免疫共沉淀檢測Gankyrin與MDM2在膀胱癌中的相互作用,以探討Gankyrin調(diào)控膀胱癌侵襲進展的可能機制。【結(jié)果】1.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明Gankyrin表達量在9例膀胱癌組織中高于對應(yīng)癌旁正常尿路上皮組織,對10對癌及癌旁組織RPKM值進行統(tǒng)計分析,Gankyrin在膀胱癌組織中表達顯著上調(diào)(P0.05),差異表達倍數(shù)為1.21倍。2.通過qRT-PCR檢測90例膀胱癌患者中Gankyrin mRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)其中66例患者腫瘤組織中Gankyrin mRNA表達量高于癌旁正常組織,24例患者中腫瘤組織Gankyrin表達量低于癌旁組織,Gankyrin高表達比例為73.3%。對20對膀胱癌組織及癌旁正常組織進行western blot檢測,發(fā)現(xiàn)其中17例樣本的腫瘤組織中Gankyrin蛋白的表達量明顯高于癌旁正常組織。3.公共數(shù)據(jù)庫Oncomine檢索發(fā)現(xiàn)Dyrskjot Bladder 3數(shù)據(jù)集中,Gankyrin mRNA在膀胱癌患者腫瘤組織中的表達含量高于正常尿路上皮組織(P0.01)。4.在3例膀胱癌病理大切片中,Gankyrin表達量從粘膜、淺肌層到深肌層逐漸升高;130例免疫組化的結(jié)果顯示,Gankyrin表達量在肌層浸潤性膀胱癌中顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌(P0.01)、在高級別膀胱癌組織中顯著高于低級別組織(P0.01),Gankyrin高表達患者總體生存期、疾病特異性生存期和無進展生存期顯著低于低表達患者(均P0.001),多因素分析顯示,Gankyrin為膀胱癌不良預(yù)后的獨立危險因素。5.western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示,Gankyrin在膀胱癌細胞系中的表達量高于正常尿路上皮細胞系,Gankyrin在NMIBC細胞系BIU87和SW780中表達量低,而在MIBC細胞系UMUC3和J82中存在高表達。6.成功構(gòu)建Gankyrin穩(wěn)定過表達的BIU87細胞株和Gankyrin穩(wěn)定敲低的UMUC3細胞株,EdU細胞增殖實驗表明Gankyrin穩(wěn)定過表達的BIU87細胞增殖能力顯著強于對照組(P0.01),而Gankyrin穩(wěn)定敲低的UMUC3細胞的增殖能力顯著降低(P0.001);Gankyrin穩(wěn)定過表達后的BIU87細胞小鼠皮下腫瘤增殖能力明顯強于對照組(P0.001),而Gankyrin穩(wěn)定敲低的UMUC3細胞小鼠皮下腫瘤增殖能力顯著弱于對照組(P0.001);劃痕實驗和Transwell小室遷移實驗顯示,Gankyrin穩(wěn)定過表達的BIU87細胞遷移能力顯著增強,Gankyrin穩(wěn)定敲低的UMUC3細胞遷移能力顯著下降;Transwell小室侵襲實驗顯示,Gankyrin過表達可顯著增強膀胱癌細胞的侵襲能力,而Gankyrin敲低可顯著抑制膀胱癌細胞的侵襲能力。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示Gankyring過表達或敲低并不影響B(tài)IU87或UMUC3細胞的凋亡。7.成功利用BBN誘導小鼠自發(fā)形成膀胱癌,免疫組化結(jié)果顯示,Gankyrin在膀胱癌中的表達量高于正常尿路上皮組織,在NMIBC、MIBC及肺轉(zhuǎn)移組織中表達量逐漸升高。8.32例膀胱癌連續(xù)切片免疫組化顯示,Gankyrin和MDM2呈正相關(guān)(R=0.583,P0.001)。上調(diào)BIU87細胞Gankyrin表達量,MDM2表達相應(yīng)上調(diào),下調(diào)UMUC3細胞Gankyrin表達量,MDM2表達相應(yīng)下調(diào),免疫熒光顯示Gankyrin和MDM2在BIU87細胞及膀胱癌組織中存在共定位,蛋白免疫共沉淀顯示Gankyrin和MDM2在BIU87細胞中相互結(jié)合�！窘Y(jié)論】癌蛋白Gankyrin在膀胱癌組織中顯著上調(diào),Gankyrin的表達水平升高與膀胱癌的分期分級升高密切相關(guān),且是膀胱癌不良預(yù)后的獨立危險因素。上調(diào)Gankyrin的表達可以增強膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,下調(diào)Gankyrin的表達顯著抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。Gankyrin在膀胱癌中與MDM2直接結(jié)合,為調(diào)控膀胱癌侵襲進展的潛在分子機制。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14
【圖文】：

圖 1. 膀胱癌侵襲進展的分子機制26S 蛋白酶體非 ATP 酶亞基 10（26S proteasome non-ATPase regulatory subunD10），又稱 p28GANK、p28、Gankyrin，位于人類的 X 染色體 22 區(qū) 3 帶上，蛋白 Gankyrin 由 226 個氨基酸殘基所組成，并且有 2 個典型的結(jié)構(gòu)域：7 個錨序列和視網(wǎng)膜母細胞瘤識別序列，其表達在眾多惡性腫瘤中有著重要臨床意yrin 最初在肝癌研究中被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、胰腺、肺癌和食道癌等惡性腫瘤也存在高表達[15][18-22]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Gankyrin 通4 相互作用來調(diào)控抑癌蛋白 Rb 的磷酸化，并且通過結(jié)合 E3 泛素連接酶 Mdm p53 的泛素化，最終促進 Rb 和 p53 的降解，有助于惡性腫瘤的形成[23-27]。也明 Gankyrin 可與 RelA 相互作用，通過 SIRT1 的乙酰化來抑制 NF-Κb 的活性有研究表明 Gankyrin 可結(jié)合 HNF4α，促進其降解并決定腫瘤的分化程度，也合 KEAP1 來抑制 Nrf2 的降解，在腫瘤的氧化應(yīng)激和線粒體損傷中起作用[30,根據(jù)膀胱癌經(jīng)典分子機制學說，肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌來源子通路改變[4]，其中，肌層浸潤性膀胱癌的特征性分子通路改變之一為 P53 信

圖 2. Gankyrin 在 10 對膀胱癌及癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果A. Gankyrin 在 10 對膀胱癌及癌旁組織中的 RPKM 值B. Gankyrin 在 10 對膀胱癌及癌旁組織中 PRKM 值的統(tǒng)計分析注：*p 值＜0.052、在膀胱癌及癌旁組織中驗證 Gankyrin 的高表達如圖2A所示，在20例膀胱癌患者腫瘤及癌旁組織樣本中，western blot顯示Ganky蛋白在 17 例樣本的腫瘤組織中的表達量高于癌旁組織，經(jīng)統(tǒng)計分析，膀胱癌組織Gankyrin 蛋白表達量顯著高于癌旁組織（圖 3B，P＜0.01）。實時定量 PCR 結(jié)果顯示Gankyrin mRNA 表達量在 66 例患者的腫瘤組織中高于癌旁組織，在 24 例患者腫瘤組中低于癌旁組織，高表達比例為 73.3%。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長嶺;;中國膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢分析[J];癌癥進展;2013年01期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 趙曉芳;Gankyrin在CCl4誘導的肝纖維化—肝癌發(fā)生中的作用及機制研究[D];南京大學;2015年

本文編號：2721103