【摘要】：1研究背景肺癌嚴(yán)重危害人類生命健康,目前為我國惡性腫瘤死因的第一位,且其發(fā)病率仍在不斷提高。原發(fā)性中央型氣道非小細(xì)胞肺癌是指原發(fā)于氣管、主支氣管和右中間段支氣管的非小細(xì)胞性惡性上皮性腫瘤,與其他部位肺癌相比,該類腫瘤在病理組織學(xué)特征、臨床特點(diǎn)、中醫(yī)證候分布等方面尚不明確,從而給本疾病的中醫(yī)、西醫(yī)治療治療造成困難。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),中央型氣道非小細(xì)胞肺癌中,涎腺型癌占很高的比例,這不僅給西醫(yī)的病理診斷造成極大困難,同時(shí)也為涎腺型癌的中醫(yī)證候研究帶來了新課題。因此,有必要對本組腫瘤進(jìn)行系統(tǒng)的病理學(xué)分析、組織學(xué)鑒別診斷、中醫(yī)證候分析、化療及預(yù)后指標(biāo)研究等,以期全面地了解其西醫(yī)分類和中醫(yī)證候的特點(diǎn)及內(nèi)在聯(lián)系,為更有針對性地進(jìn)行中西醫(yī)治療提供理論基礎(chǔ)。本課題獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)中青年教師課題資助。2研究目的通過對一組中央型氣道非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行經(jīng)典病理學(xué)、中醫(yī)辨證分型、免疫組織化學(xué)及分子病理學(xué)研究,達(dá)到以下目的：①闡明中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的臨床病理特點(diǎn),為西醫(yī)治療方案的選擇提供指導(dǎo)；②系統(tǒng)研究和探討中央型氣道非小細(xì)胞肺癌中醫(yī)證候的分布情況,確立其與病理組織學(xué)、臨床特征、腫瘤TNM分期等的相關(guān)性,為今后更好地指導(dǎo)中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的中西醫(yī)結(jié)合治療提供參考依據(jù)；③找到一個(gè)簡單、高效及最優(yōu)化的抗體組合,用以鑒別中央氣道型肺癌的不同組織學(xué)類型,包括鱗癌、腺癌、腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌、肌上皮癌、涎腺腺癌(非特指)等；④探討ERCC1、Beta-tubulin這兩種與化療藥物選擇、估計(jì)預(yù)后相關(guān)指標(biāo)在中央型氣道非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá),以及與不同中醫(yī)證候的關(guān)系；⑤通過研究中央型氣道非小細(xì)胞肺癌不同組織學(xué)類型中ALK基因異常情況,探討克唑替尼等靶向藥物用于本組病人治療的可能性。3研究對象研究對象為病理學(xué)診斷證實(shí)的肺原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌,臨床分期為Ⅲ期及Ⅳ期的患者,病變部位為中央型氣道；病例來源為2013年6月至2014年5月間北京煤炭總醫(yī)院腫瘤微創(chuàng)治療中心收治的支氣管鏡介入性治療的肺癌患者,治療時(shí)收集其切除的腫瘤標(biāo)本,并收集其臨床資料；共收集符合入組標(biāo)準(zhǔn)的109例病人的標(biāo)本,其中男性91例,女性18例,年齡最小29歲,最大者86歲,中位年齡62歲。4研究內(nèi)容及方法4.1研究內(nèi)容①中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的病理組織學(xué)類型及臨床特點(diǎn)；②中央氣道型非小細(xì)胞肺癌的中醫(yī)證候分布特征,以及與病理組織學(xué)、TNM分期等的關(guān)系；③優(yōu)化免疫組化抗體組合,以鑒別不同組織學(xué)類型的中央型氣道非小細(xì)胞肺癌；④ERCC1、Beta-tubulin在中央型氣道非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)規(guī)律,以及與中醫(yī)證候的關(guān)系;⑤ALK基因的異常改變情況。4.2研究方法4.2.1中醫(yī)證候判定及臨床數(shù)據(jù)采集中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2002版《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》。TNM分期根據(jù)2009年AJCC第7版非小細(xì)胞肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)。通過查閱文獻(xiàn),設(shè)計(jì)詳細(xì)的CRF表,從病人的病歷記錄中提取基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料,對所有的病人進(jìn)行床旁深度訪談問診及體格檢查,以確定病人的中醫(yī)證候；所有入組的病人均有病理組織學(xué)診斷證實(shí),凡不符合要求者隨后剔除,不納入本研究。4.2.2組織處理及病理學(xué)診斷肺癌的組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2004WHO肺癌腫瘤分類以及2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)本經(jīng)中性緩沖福爾馬林固定8-72小時(shí),自動(dòng)脫水機(jī)脫水,常規(guī)石蠟包埋;制備厚度4微米連續(xù)切片,用于HE染色及免疫組化染色；使用全自動(dòng)組織芯片儀制作組織芯片,用于免疫組化染色。所有切片均由2名高級職稱病理醫(yī)師分別雙盲組織學(xué)觀察、免疫組化觀察及評分。對于診斷有分歧的病例則在多頭鏡下,共同協(xié)商確定組織學(xué)診斷及免疫組化評判。4.2.3免疫組化染色及判斷標(biāo)準(zhǔn)4.2.3.1 ALK-D5F3ALK-D5F3工作液,使用Ventana全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)染色。陽性者為腫瘤細(xì)胞中存在強(qiáng)的顆粒狀胞漿染色,排除已知的染色因素,包括肺泡巨噬細(xì)胞胞漿中較淡的點(diǎn)彩狀染色、神經(jīng)纖維及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、浸潤的淋巴細(xì)胞、壞死物及粘液等；ALK-D5F3陰性對照：腫瘤細(xì)胞內(nèi)不存在強(qiáng)的顆粒狀胞漿染色。4.2.3.2 p63p63原液,1：200稀釋度,使用Ventana全目動(dòng)免疫組化機(jī)染色。P63陽性染色定義為明確的核著色,p63表達(dá)陽性標(biāo)準(zhǔn)為陽性細(xì)胞數(shù)目≥10%全部腫瘤細(xì)胞數(shù)。同時(shí)觀察p63陽性細(xì)胞分布特點(diǎn),分為兩種：彌漫性及癌巢周邊部“鑲邊狀”分布。4.2.3.3 p40p40鼠單抗原液,1：200稀釋度,使用Ventana全自動(dòng)免疫組化機(jī)染色。p40染色與p63相同,為核陽性著色,p40表達(dá)陽性病例判斷標(biāo)準(zhǔn)為陽性細(xì)胞數(shù)≥10%者。記錄陽性細(xì)胞分布特點(diǎn),分為兩種：彌漫性及癌巢周邊部分布。4.2.3.4 TTF-1TTF-1鼠單抗原液,1：200稀釋度,使用Ventana全自動(dòng)免疫組化機(jī)染色。TTF-1為核陽性著色。陽性細(xì)胞數(shù)≥10%者判斷為陽性,其余的為陰性。4.2.3.5 Ki-67Ki-67克隆號MIB-1抗體原液,1：200稀釋度,使用Ventana全自動(dòng)免疫組化機(jī)染色。Ki-67為核陽性著色,計(jì)算方法為Ki-67指數(shù),即核陽性細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。4.2.3.6 SMASMA單抗原液1：100稀釋度,使用前述手工免疫組化染色流程,陽性著色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)較強(qiáng)的棕黃色著色。對于陽性者,同時(shí)觀察其細(xì)胞分布特點(diǎn),包括彌漫性分布或在腫瘤細(xì)胞巢周圍環(huán)繞狀分布。4.2.3.7 ERCC1ERCC1鼠單抗原液,稀釋度1：300,使用前述手工免疫組化染色流程,陽性著色為核陽性著色。ERCC1核表達(dá)分為四級：無任何陽性細(xì)胞或10%陽性,得分為0;10%核隱隱／幾乎難以察覺的部分腫瘤細(xì)胞表達(dá)者,得分1+；10%腫瘤細(xì)胞核呈中等強(qiáng)度染色得分2+;10%腫瘤細(xì)胞核呈強(qiáng)陽性染色,得分3+。本研究采用兩級標(biāo)準(zhǔn)：2+或3+分為陽性,0分或1+為陰性。4.2.3.8 Beta-tubulinBeta-tubulin鼠單抗原液,稀釋度1：100,使用前述手工免疫組化染色流程,陽性著色為胞漿棕黃色著色。Beta-tubulin表達(dá)評分為為4級,胞漿無著色者為0分：較弱的剛剛能觀察到的10%的腫瘤細(xì)胞胞漿著色為1+；10%腫瘤細(xì)胞弱到中等強(qiáng)度著色為2+；10%腫瘤細(xì)胞強(qiáng)胞漿著色為3+；本研究采用兩級分類標(biāo)準(zhǔn),0和1+為陰性,2+及3+為陽性。4.2.4 ALK-FISH商用的ALK基因的斷裂-分離雙色探針按照制造商的說明進(jìn)行染色。該5'ALK探針標(biāo)記SpectrumGreen,3'ALK探針標(biāo)記SpectrumOrange。染色在組織芯片的石蠟切片上進(jìn)行。用熒光顯微鏡在100X油鏡下,每例觀察至少100個(gè)非重疊的細(xì)胞內(nèi)的雜交信號。ALK-FISH陽性的標(biāo)準(zhǔn)為100個(gè)分析細(xì)胞中,大于等于15個(gè)細(xì)胞顯示ALK基因的熒光探針的側(cè)面分離,紅綠信號分離的距離超過2個(gè)信號直徑。如果陽性細(xì)胞數(shù)介于5-15之間,則需另外計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,若大于等于15個(gè)陽性細(xì)胞,仍可視為ALK FISH陽性。4.2.5統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)數(shù)資料使用非參數(shù)的卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料使用t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)使用秩和檢驗(yàn)。5研究結(jié)果5.1中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的病理及臨床特點(diǎn)5.1.1病理組織學(xué)類型的構(gòu)成,鱗癌69例,占63.3%,涎腺型癌27例,占24.8%,腺癌10例,占9.2%,其他的腺鱗癌2例、癌肉瘤1例。涎腺型癌中,腺樣囊性癌最多見,占55.6%,肌上皮癌占22.2%,涎腺腺癌(非特指)占14.8%,其中肌上皮癌有涎腺腺癌(非特指)為罕見的原發(fā)于肺的涎腺型癌。5.1.2臨床病理特點(diǎn)：老年、男性、吸煙病人以鱗癌為主；年輕、女性、不吸煙病人以涎腺型癌為主。5.2中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的中醫(yī)證候及分布特點(diǎn)5.2.1本組共109例肺癌中,氣虛痰濕證36例,陰虛熱毒證12例,氣陰兩虛證40例,氣血瘀滯證21例；從其分布特點(diǎn)來看,鱗癌及涎腺型癌患者中,以氣陰兩虛證為最多見,分別占41.4%及40.7%；腺癌中以氣虛痰濕證為最多見,占50%。5.2.2中醫(yī)證候與年齡、性別、吸煙史及卡氏評分等均相關(guān),老年病人、男性、有吸煙史、卡氏評分高于60分者,均以氣陰兩虛證為主；而年輕病人、女性、無吸煙史、卡氏評分低于60分者,多以氣虛痰濕證候?yàn)橹鳌?.3免疫組化鑒別診斷及與中醫(yī)證候的關(guān)系5.3.1 p63不同中醫(yī)證候間p63陽性表達(dá)率有極顯著性差異(P0.01),其中在氣陰兩虛證候中陽性率為97.5%,而在陰虛熱毒證病人中陽性率較低,約66.7%。p63在不同病理組織學(xué)類型癌中表達(dá)有極顯著性差異(P0.01),其中在鱗癌中的表達(dá)率100%,腺癌中無一例陽性表達(dá),涎腺型癌中陽性率約81.5%。p63在鱗癌、肌上皮癌中呈彌漫性／彌散性表達(dá),但在腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌中,呈癌巢周圍“鑲邊狀”分布。彌漫性p63陽性對于診斷鱗癌的敏感性為100%,特異性為82.5%;p63"鑲邊狀”陽性對于腺樣囊性癌和粘液表皮樣癌診斷的特異性及敏感性均為100%。5.3.2 p40不同中醫(yī)證候間p40陽性表達(dá)率有極顯著性差異(P0.01),其中氣陰兩虛證陽性率高(97.5%),而陰虛熱毒證病人陽性率較低(58.3%)。p40在不同病理組織學(xué)類型癌中表達(dá)有極顯著性差異(P0.01),其中在鱗癌中的表達(dá)率100%,腺癌中無一例陽性表達(dá),涎腺型癌中陽性率約77.8%。p40在鱗癌、肌上皮癌中呈彌漫性／彌散性表達(dá),但在腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌中,呈癌巢周圍“鑲邊狀”分布。彌漫性p40陽性對于診斷鱗癌的敏感性為100%,特異性為90.0%; p40“鑲邊狀”陽性對于腺樣囊性癌和粘液表皮樣癌診斷的特異性及敏感性均為100%。5.3.3 TTF-1TTF-1在鱗癌無一例表達(dá),腺癌陽性率為50%,涎腺型癌有2例個(gè)別細(xì)胞陽性,但10%,未達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)；TTF-1對腺癌診斷的敏感性為50%,特異性為100%。5.3.4 SMASMA在鱗癌及腺癌中無一例表達(dá)。在肌上皮癌中,呈彌漫性陽性表達(dá)(100%),在腺樣囊性癌中,為癌巢周圍“鑲邊狀”陽性表達(dá),陽性率93.3%�！拌傔厾�"SMA陽性對腺樣囊性癌+粘液表皮樣癌診斷的敏感性為94.1%,特異性為100%。5.3.5 Ki-67Ki-67指數(shù)在涎腺型癌與非涎腺型癌兩組之間比較有極顯著性差異,涎腺型癌的Ki-67指數(shù)平均數(shù)顯著低于非涎腺型癌者。5.3.6 ERCC1與Beta-tubulinERCC1陽性率在不同中醫(yī)證候病例間有極顯著性差異(P0.01),在氣虛痰濕證及氣血瘀滯證中陽性率較高,而在陰虛熱毒證中表達(dá)較低。Beta-tubulin陽性率在不同病理組織學(xué)類型間有極顯著性差異(P0.01),在腺癌中陽性率較高,而在涎腺型癌中表達(dá)較低。5.4 ALK免疫組化及ALK-FISH通過免疫組化和FISH的方法,共檢測出3例ALK陽性肺癌,其中腺癌2例,占20%,鱗癌1例,占1.45%。6結(jié)論6.1明確了中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的中醫(yī)證候分布及臨床特征：男性、吸煙、鱗癌病人多為氣陰兩虛證,女性、不吸煙、涎腺型癌／腺癌病人,多為氣虛痰濕證或陰虛熱毒證。6.2 ERCC1在氣虛痰濕證及氣血瘀滯證中陽性率高,在陰虛熱毒證中表達(dá)較低；Beta-tubulin在腺癌中表達(dá)最高,其次是鱗癌,在涎腺型癌中表達(dá)最低。ERCC1及Beta-tubulin的表達(dá)檢測可為選擇化療藥物、判斷病人預(yù)后有參考價(jià)值。6.3闡明了中央型氣道非小細(xì)胞肺癌有其獨(dú)特的臨床病理特點(diǎn),包括：①主要由鱗癌、涎腺型癌、腺癌3種組織學(xué)類型；②涎腺型癌占很高的比例；③有肌上皮癌、涎腺腺癌(非特指)等少見類型；④老年、男性、吸煙病人以鱗癌為主;年輕、女性、不吸煙病人以涎腺型癌為主。6.4證實(shí)了p40/TTF-1/SMA三種抗體作為高效的組合,可以鑒別中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的組織類型：①鱗癌：p40彌漫性／彌散性(+),TTF-1(-),SMA(-);②腺癌：p40陰性,TTF-1(+)或(-),SMA(-)；③腺樣囊性癌／粘液表皮樣癌：p40及SMA癌巢周“鑲邊狀”(+),TTF-1(-),個(gè)別散在弱(+)；④肌上皮癌：SMA(+),p40部分彌散性(+),TTF-1(-)；⑤涎腺腺癌,非特指：p40陰性,SMA陰性,TTF-1(-)；⑥p40對鱗癌診斷的特異性高于p63;⑦涎腺型癌的Ki-67指數(shù)低于鱗癌及腺癌。6.5 中央型氣道腺癌、鱗癌均有ALK基因重排,適合選擇分子靶向藥物治療。涎腺型癌中未發(fā)現(xiàn)有ALK的基因重排異常。7創(chuàng)新點(diǎn)7.1首次以中央型氣道非小細(xì)胞肺癌為研究對象,闡明了不同不醫(yī)證候各自的組織學(xué)特點(diǎn)及臨床特征,從而為更有針對性地中西醫(yī)治療提供理論基礎(chǔ)；7.2找到了一個(gè)最佳抗體組合,用以鑒別診斷中央型氣道非小細(xì)胞肺癌的各種組織學(xué)類型,并研究了ERCC1, Beta-tubulin, ALK等治療靶標(biāo)在不同類型癌中的表達(dá)特點(diǎn)及最優(yōu)的化療藥物選擇方案。
【圖文】：

圖２肺淲癌、肺腺癌中的主要信號通路及其功能逡逑引自視她，ＢＡ，Ｈｕｇｈｅｓ，邋ＢＧ邋Ｔｒａｎｓｌ邋Ｌｕｎｇ邋Ｃａｎｃｅｒ邋２０１５，，４（１）３６－５因子受體（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ邋ｇｒｏｗ化邋ｆａｄｏｒ邋ｗｅｅｐ化ｒ，ＥＧＦＲ）逡逑的分布與功能逡逑

發(fā)現(xiàn)有已知的驅(qū)動(dòng)基因突變，見圖ｉＰ４１。涉及的主要信號通路包括逡逑ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫｓ邋ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－邋ｍＴＯ民或邋ＪＡＫ－ＳＴＡＴ邋通路等，見逡逑圖２。通過使用小分子抑制物或受體的單克隆抗體，從而抑制上調(diào)的信號通路，逡逑繼而獲得很好的X1向治療效果。其中目前使用最廣的分別是針對ＥＧＦＲ和ＡＬＫ信逡逑號通路的祀向治療。逡逑４０逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 李秀義;NK細(xì)胞活性改變及化療對肺癌患者的影響[J];安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2004年03期

2 陳萬靈;歐陽學(xué)農(nóng);余宗陽;房文錚;王文武;張霞;鄧水秋;葉志橋;林靜瓔;;中晚期非小細(xì)胞肺癌常見中醫(yī)證型與血清前炎癥因子水平相關(guān)性研究[J];中華中醫(yī)藥雜志;2012年06期

3 趙永祥,廖春梅,胡冬煦,周漢槎,陳勝喜,郭實(shí)士;肺癌病人外周血NK細(xì)胞與TNF檢測及其臨床意義[J];中國醫(yī)師雜志;2000年12期

4 裘宇容,曾方銀,楊春莉;流式細(xì)胞儀對4種癌癥病人T淋巴細(xì)胞亞群的檢測[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1998年02期

5 蔡紅兵,代方國,閔清芬,石敏,繆景霞,羅榮城;中醫(yī)藥配合放療治療非小細(xì)胞肺癌的臨床研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年12期

6 羅凌飛;王洪武;馬洪明;鄒珩;李冬妹;周云芝;;靶動(dòng)脈栓塞化療聯(lián)合氬氦刀等微創(chuàng)技術(shù)治療原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌139例分析[J];中國肺癌雜志;2010年01期

7 王洪武;張浩波;;中央型氣道狹窄的診斷與腔內(nèi)治療[J];中國肺癌雜志;2011年09期

8 曹洋;;淺談肺癌的中醫(yī)藥治療體會(huì)[J];光明中醫(yī);2011年05期

9 韓仁強(qiáng);鄭榮壽;張思維;武鳴;陳萬青;;1989年-2008年中國肺癌發(fā)病性別、城鄉(xiāng)差異及平均年齡趨勢分析[J];中國肺癌雜志;2013年09期

10 孟曉;韓燕;徐詠梅;張青;富琦;趙文碩;王笑民;楊國旺;;180例晚期非小細(xì)胞肺癌患者中醫(yī)證候分布與組合規(guī)律[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年09期

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本文編號：2707147