【摘要】：研究目的探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIST(lncRNA-XIST)在胃癌組織及血漿中表達(dá)水平與臨床意義。原代培養(yǎng)人胃粘膜成纖維細(xì)胞(Human gastric mucosa fibroblast,HGMF),并在缺氧條件下刺激其活化。在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證長(zhǎng)鏈非編碼RNA-XIST基因(Long non-coding RNA,lncRNA-XIST)是否與胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化相關(guān)。并尋找可能與RNA-XIST促GCAF活化相關(guān)的差異表達(dá)基因與信號(hào)通路(Pathway)。研究方法收集40例胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本,抽取90例胃癌患者術(shù)前血漿樣本和90例健康體檢者血漿樣本。利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測(cè)上述標(biāo)本中l(wèi)ncRNA-XIST的表達(dá)水平。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并判斷l(xiāng)ncRNA-XIST表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)(年齡、性別、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、Ki-67陽(yáng)性率)的關(guān)系。通過(guò)繪制受試者工作特征(ROC)曲線,評(píng)價(jià)血漿lncRNA-XIST在診斷胃癌時(shí)的效能。收集胃癌患者術(shù)中切除的正常胃粘膜組織,用組織塊培養(yǎng)法對(duì)胃粘膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。成功培養(yǎng)后,光學(xué)顯微鏡下鑒定其形態(tài)特征,同時(shí)用免疫熒光染色鑒定確認(rèn)細(xì)胞來(lái)源及純度;將HGMF與胃癌細(xì)胞(SGC-7901和MGC-803)共培養(yǎng),通過(guò)間隙性缺氧處理構(gòu)建GCAF的體外活化模型。建模成功后,用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中α-SMA、FAP的表達(dá)情況,利用CCK-8試驗(yàn)、Transwell遷移試驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移及抗凋亡能力,驗(yàn)證是否建模成功;利用qPCR檢測(cè)GCAF活化前后的lncRNA-XIST基因表達(dá)變化情況,驗(yàn)證lncRNA-XIST與GCAF的活化是否存在相關(guān)性。利用siRNA干擾GCAF中的lncRNA-XIST基因表達(dá),用ELISA法檢測(cè)相關(guān)活化因子表達(dá)水平。利用CCK-8法、Transwell侵襲試驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后GCAF的增殖、侵襲及抗凋亡能力,證實(shí)lncRNA-XIST與GCAF活化明確相關(guān);用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA Sequencing,RNA-seq)檢測(cè)和分析出siRNA轉(zhuǎn)染GCAF后的差異基因和相關(guān)通路,探尋LncRNA-XIST參與GCAF活化的具體機(jī)制。研究結(jié)果胃癌組織中l(wèi)ncRNA-XIST表達(dá)較癌旁組織升高,胃癌組血漿lncRNA-XIST表達(dá)高于健康體檢組;差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。胃癌組織及血漿中的lncRNA-XIST表達(dá)水平與胃癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度相關(guān)(P均0.05)。培養(yǎng)出的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),大小一致,呈長(zhǎng)條形或梭狀,排列方向大體一致,符合成纖維細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。免疫熒光鑒定結(jié)果顯示細(xì)胞結(jié)蛋白(Desmin)表達(dá)陰性,而波形絲蛋白(Vimentin)表達(dá)陽(yáng)性,符合HGMF的蛋白特征,證明原代培養(yǎng)成功。建立GCAF活化模型后,細(xì)胞培養(yǎng)液中CXCL12、IL-6、TGF-β1及HGF表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(HGMF),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。GCAF中α-SMA、FAP相關(guān)mRNA較對(duì)照組表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05);GCAF活化后的細(xì)胞增殖、遷徙、抗凋亡能力較HGMF明顯增強(qiáng)(P0.05);GCAF的lncRNA-XIST表達(dá)量較HGMF顯著上調(diào)(P0.05)。慢病毒轉(zhuǎn)染后,培養(yǎng)液中前述活化效應(yīng)分子表達(dá)水平均低于空白組和陰性對(duì)照組(P0.05),且細(xì)胞的增殖、遷移及抗凋亡能力下降(P0.05);干擾lncRNA-XIST表達(dá)后,H19、PTP4A1、EIF3E、KLF5、ALB、CYP24A1等基因差異表達(dá),主要參與組織細(xì)胞組成和生物合成的調(diào)節(jié)、有絲分裂細(xì)胞周期等生物過(guò)程;參與的細(xì)胞組織有囊泡、細(xì)胞骨架、膜組織等,參與粘附斑激酶信號(hào)通路、FcγR介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬作用等信號(hào)通路。研究結(jié)論lncRNA-XIST在胃癌組織及血漿中表達(dá)升高,并可以促進(jìn)GCAF的活化過(guò)程;下調(diào)LncRNA-XIST表達(dá)可以抑制GCAF的增殖與遷移能力,并促進(jìn)其凋亡,提示LncRNA-XIST有可能成為胃癌新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析。所有資料均用 Shapira-Wilkinson 法檢其正態(tài)性。若計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用（x s）表示，兩組比較用 t 檢驗(yàn)，多組較用方差分析；若不符合正態(tài)分布，則用 M（Q1，Q3）表示，組間比較采用非參檢驗(yàn)。通過(guò)繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線判斷漿中 lncRNA-XIST 表達(dá)水平在胃癌診斷中的靈敏度和特異度。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05 表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、胃癌組織及血漿中l(wèi)ncRNA-XIST的表達(dá)水平 根據(jù)qRT-PCR數(shù)據(jù)計(jì)算出的2-△ Ct值表lncRNA-XIST與內(nèi)參基因表達(dá)水平的相對(duì)倍數(shù)關(guān)系，2-△ Ct值越大表示lncRNA-XIST表達(dá)水平高。結(jié)果顯示，胃癌組織lncRNA-XIST的2-△ Ct值為0.150(0.094,0.247)，高于癌旁組織[0.0850.041,0.193）]，，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012，圖1.1A）。胃癌患者術(shù)前靜脈血漿lncRNA-XIST2-△ Ct值為0.189（0.119,0.256），與健康體檢者[0.144(0.095,0.180)]相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01，圖1.1B）。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA-XIST 與胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞活化的相關(guān)性研究測(cè)時(shí)，均高于 CEA、CA199、CA724 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)效力（圖 1.2，表 1.3）。漿 lncRNA-XIST 診斷 TNMⅠ~Ⅱ期胃癌時(shí) AUC 為 0.694(95%CI 0.592～0.796，P0.01)，靈敏度為 38.5%，特異度為 95.6%，也均優(yōu)于 CEA、CA199、CA724 單獨(dú)及合檢測(cè)（圖 1.3、表 1.3）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳在昌;張浩;申曉軍;畢建威;;胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響[J];上海醫(yī)學(xué);2011年07期

本文編號(hào)：2707110