【摘要】：背景與目的肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在我國惡性腫瘤患者死亡率中排名第二。奧沙利鉑(oxliaplatin,L-OHP)是一類新的鉑類化療藥,通過形成烷化結(jié)構(gòu)使DNA發(fā)生鏈內(nèi)與鏈間交聯(lián),阻斷細(xì)胞DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,從而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用和抗腫瘤活性。近年臨床文獻(xiàn)表明,以L-OHP為主的化療方案對HCC患者有較好的療效,安全性和耐受性高,不良反應(yīng)輕。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是由腫瘤細(xì)胞周圍的活性因子(如細(xì)胞因子)、化學(xué)物質(zhì)(如葡萄糖、氧分子、氫離子)、非惡性細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)、結(jié)構(gòu)成分(如細(xì)胞外基質(zhì))等構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境涉及腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥機(jī)制。微環(huán)境化學(xué)因素對L-OHP的HCC細(xì)胞生物效應(yīng)究竟有無影響及其機(jī)制如何,目前尚缺乏報道。我們針對這一問題開展研究,旨在為改良HCC局部化療方法提供相應(yīng)的實驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。實驗方法1.選擇SMMC-7721 HCC細(xì)胞株,體外培養(yǎng)與分組。將葡萄糖(glucose)、氧(O2)、乳酸(lactic acid)、碳酸氫鹽(bicarbonate)各濃度作為腫瘤微環(huán)境變量因素對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行不同組合的處理,其中高糖(high glucose,含4.5 g/L葡萄糖)培養(yǎng)8組:高糖常氧(normoxia,20%O2培養(yǎng))、高糖缺氧(hypoxia,1%O2培養(yǎng))、高糖常氧乳酸酸中毒(培養(yǎng)基加純?nèi)樗嶂两K濃度20 mmol/L,p H 6.7)、高糖缺氧乳酸酸中毒、高糖常氧代謝性堿中毒(培養(yǎng)基加5%碳酸氫鈉溶液,p H 8.0)、高糖缺氧代謝性堿中毒、高糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒(培養(yǎng)基p H調(diào)至7.0)、高糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒;低糖(low glucose,含1.0 g/L葡萄糖)培養(yǎng)8組:低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒。光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)與生長狀態(tài)。采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的OD值;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期百分含量;采用Hoechst 33342染色法檢測細(xì)胞凋亡數(shù);采用Annexin V-FITC/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡率;采用Transwell小室、劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移率。通過上述研究觀察微環(huán)境中不同化學(xué)因素對HCC細(xì)胞的生物效應(yīng)。2.選擇對HCC細(xì)胞影響顯著的微環(huán)境化學(xué)因素作為培養(yǎng)條件,并選取0.625μg/ml、1.250μg/ml、2.500μg/ml、5.000μg/ml、10.000μg/ml、20.000μg/ml、40.000μg/ml、80.000μg/ml和160.000μg/ml 9個不同L-OHP終濃度處理SMMC-7721 HCC細(xì)胞24 h、48 h、72 h,采用CCK-8法檢測OD值,觀察該化學(xué)性微環(huán)境中L-OHP半數(shù)致死濃度,確定后續(xù)實驗采用的L-OHP濃度。3.應(yīng)用選定的L-OHP濃度,在觀察到的微環(huán)境中不同化學(xué)因素對HCC細(xì)胞生物效應(yīng)影響的基礎(chǔ)上分組處理細(xì)胞。光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)與生長狀態(tài)。采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞處理后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的OD值;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各L-OHP處理組細(xì)胞周期百分含量;采用Hoechst 33342染色法檢測各L-OHP處理組凋亡細(xì)胞數(shù);采用Annexin V-FITC/PI染色法檢測各L-OHP處理組細(xì)胞凋亡率;采用Transwell小室實驗檢測各L-OHP處理組細(xì)胞遷移率。通過這些實驗觀察微環(huán)境不同化學(xué)因素對L-OHP的HCC細(xì)胞生物效應(yīng)的影響。4.選擇對HCC細(xì)胞影響顯著的微環(huán)境因素,并采用選定濃度的L-OHP分組分別處理SMMC-7721株與Bel-7404株HCC細(xì)胞,采用Western blot法檢測胞內(nèi)SET7/9、p53、p65表達(dá),初步探討微環(huán)境不同化學(xué)因素影響L-OHP的HCC細(xì)胞生物效應(yīng)的機(jī)制。實驗結(jié)果1.光鏡下可見,各高糖處理組細(xì)胞皆呈三角形貼壁生長;各低糖處理組中,低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒組細(xì)胞變長,貼壁生長,而低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒時細(xì)胞于72 h漂浮死亡。2.CCK-8法檢測結(jié)果顯示培養(yǎng)的HCC細(xì)胞受低糖與缺氧組合影響較為顯著,故選擇低糖缺氧(Control)、低糖缺氧乳酸酸中毒(Lactic acidosis)、低糖缺氧代謝性堿中毒(Metabolic alkalosis)、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒(Lactic acidosis+Metabolic alkalosis)4組進(jìn)行后續(xù)實驗。流式細(xì)胞術(shù)檢測、Hoechst 33342染色法檢測、Annexin V-FITC/PI染色法檢測、Transwell小室與劃痕實驗結(jié)果分別顯示:與低糖缺氧組(Control)比較,Lactic acidosis組、Lactic acidosis+Metabolic alkalosis組G1期細(xì)胞百分含量增加、凋亡數(shù)與凋亡率降低或明顯降低、細(xì)胞遷移率明顯增加,Metabolic alkalosis組細(xì)胞凋亡數(shù)與凋亡率明顯增加或增加、細(xì)胞遷移率降低。3.CCK-8法實驗結(jié)果顯示,在低糖與缺氧組合培養(yǎng)條件下,L-OHP處理HCC細(xì)胞呈現(xiàn)劑量與時間依賴性增殖抑制效應(yīng),其中10μg/ml L-OHP作用48 h HCC細(xì)胞增殖抑制率為50%。選取該L-OHP濃度分別處理低糖缺氧(L-OHP)、低糖缺氧乳酸酸中毒(Lactic acidosis+L-OHP)、低糖缺氧代謝性堿中毒(Metabolic alkalosis+L-OHP)、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒(Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP)4組HCC細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,光鏡下可見未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)細(xì)胞皺縮變圓,Lactic acidosis+L-OHP組和Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP組細(xì)胞變長貼壁生長,L-OHP組與Metabolic alkalosis+L-OHP組細(xì)胞大量死亡、漂浮。CCK-8法檢測結(jié)果還顯示與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,加用L-OHP各組24 h、48 h、72 h OD值均顯著下降;與L-OHP組比較,加用L-OHP的其它3組OD值呈不同程度變化:Metabolic alkalosis+L-OHP組OD值下降,Lactic acidosis+L-OHP組與Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP組OD值增加、尤其前者。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,L-OHP組與Metabolic alkalosis+L-OHP組S期細(xì)胞百分含量增加。Hoechst 33342染色法檢測、Annexin V-FITC/PI染色法檢測和Transwell小室實驗檢測結(jié)果顯示,與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,L-OHP組細(xì)胞凋亡數(shù)與凋亡率增加,細(xì)胞遷移率降低;與L-OHP組比較,Lactic acidosis+L-OHP組細(xì)胞凋亡率降低、細(xì)胞遷移率增加,而Metabolic alkalosis+L-OHP組細(xì)胞凋亡數(shù)與凋亡率增加、細(xì)胞遷移率明顯降低。5.Western blot檢測結(jié)果顯示,在低糖、缺氧條件下,不同微環(huán)境化學(xué)因素組合處理SMMC-7721、Bel-7404兩株細(xì)胞,與低糖缺氧組(Control)比較,Lactic acidosis組細(xì)胞內(nèi)SET7/9表達(dá)明顯增高,Metabolic alkalosis組SET7/9表達(dá)則明顯降低;p65表達(dá)未見明顯改變。相同條件聯(lián)合L-OHP分組處理兩株細(xì)胞時,與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,L-OHP組SET7/9表達(dá)明顯降低(SMMC-7721細(xì)胞)或降低(Bel-7404細(xì)胞);與L-OHP組比較,兩株細(xì)胞Lactic acidosis+L-OHP組SET7/9表達(dá)皆明顯增加,Lactic acidosis+Metabolic alkalosis組都有所增高,而Metabolic alkalosis+L-OHP組SET7/9表達(dá)都降低;p65表達(dá)也未見明顯變化。上述兩種情況下兩株HCC細(xì)胞皆未檢測到p53表達(dá)。結(jié)論1、本研究所觀察的微環(huán)境化學(xué)因素中,低糖與缺氧組合對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)最明顯。此時,乳酸酸中毒促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、遷移而抑制凋亡,代謝性堿中毒則呈現(xiàn)相反作用。2、在本研究低糖、缺氧條件下,一定濃度L-OHP能抑制HCC細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡與降低細(xì)胞遷移率,這種效應(yīng)被微環(huán)境中乳酸酸中毒削弱,但代謝性堿中毒有協(xié)同作用。3、在本研究低糖、缺氧條件下,一定濃度L-OHP在抑制HCC細(xì)胞增殖與遷移的同時會使胞內(nèi)SET7/9表達(dá)下調(diào),這種效應(yīng)受微環(huán)境中代謝性堿中毒加強(qiáng),卻受乳酸酸中毒明顯逆轉(zhuǎn)。提示蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET7/9介導(dǎo)的胞內(nèi)信號通路與L-OHP抗HCC細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制相關(guān),值得進(jìn)一步研究證實。
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第二章 實驗結(jié)果缺氧、低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒（表一和表二）。光鏡下可見，各高糖處理組細(xì)胞皆呈三角形貼壁生長；在低糖處理 72 h時，低糖常氧乳酸酸中毒組、低糖缺氧乳酸酸中毒組、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒組、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒組細(xì)胞變長，貼壁生長，，而低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒組時細(xì)胞于培養(yǎng) 72 h后細(xì)胞形態(tài)變圓，呈現(xiàn)大面積漂浮死亡現(xiàn)象（圖 2-1）�？梢娖咸烟呛繉�(xì)胞生長狀態(tài)起決定作用，低糖狀態(tài)下，乳酸酸中毒促進(jìn) HCC 細(xì)胞生長，代謝性堿中毒則抑制 HCC 細(xì)胞存活、生長。

細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)最為明顯（圖 2-2）。在觀察范圍內(nèi)，微環(huán)境無論常氧或缺氧，也無論乳酸酸中毒或代謝性堿中毒，高糖環(huán)境都能維持 HCC 細(xì)胞生長，雖然缺氧或缺氧合并乳酸酸中毒時癌細(xì)胞增殖能力不及常氧時（圖 2-2 a-d）。低糖狀態(tài)下，無論常氧或缺氧，與高糖培養(yǎng)（圖 2-2 a）相比，96 h~120 h時細(xì)胞增殖顯著受抑（圖 2-2 e）；但如果合并乳酸酸中毒，細(xì)胞卻能繼續(xù)增殖，雖然增幅不及高糖合并乳酸酸中毒，也呈現(xiàn)缺氧時細(xì)胞增殖受抑比常氧時明顯（圖 2-2 f）；如果合并代謝性堿中毒，細(xì)胞 48 h 后也出現(xiàn)細(xì)胞增殖受抑，與未合并代謝性堿中毒（圖 2-2 e）比較，細(xì)胞增殖受抑情況明顯提前，以合并缺氧時受抑效應(yīng)更顯著（圖 2-2 g）；如果同時合并乳酸酸中毒與代謝性堿中毒（圖 2-2 h），可見細(xì)胞增殖受抑效應(yīng)變小，其變化類似合并乳酸酸中毒者，缺氧時細(xì)胞增殖受抑明顯高于常氧時。這些結(jié)果多數(shù)同樣提示葡萄糖對 HCC 生長起關(guān)鍵作用，乳酸酸中毒能增加細(xì)胞對微環(huán)境中葡萄糖缺乏的耐受性，而代謝性堿中毒則降低了細(xì)胞對葡萄糖缺乏的耐受性。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2695361