【摘要】：TF在凝血過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,能與血漿凝血因子Ⅶ/Ⅶa(FⅦ/Ⅶa)特異性結(jié)合,形成的TF-FⅦa復(fù)合物可以激活FⅨ和FⅩ,激活的FX(FXa)和共因子(FVa)可以水解凝血酶原,最終導(dǎo)致凝血酶形成,引發(fā)血液凝固。越來(lái)越多的研究表明,很多實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的瘤細(xì)胞均高表達(dá)TF,因?yàn)槟[痛血管內(nèi)皮細(xì)胞本身的不完整和內(nèi)皮細(xì)胞間連接的不緊密,導(dǎo)致血管具有一定的可透過(guò)性和TF的滲漏,從而使腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)TF。這些TF既與腫瘤血管新生及轉(zhuǎn)移相關(guān),也與腫瘤患者的血栓性靜脈炎關(guān)系密切,這在臨床上被稱為Trousseau's綜合癥。而對(duì)于正常組織血管而言,TF分布在血管外層等血液循環(huán)之外的區(qū)域,只有當(dāng)血管損傷或內(nèi)皮破損時(shí)血液才有機(jī)會(huì)和這些表達(dá)TF的細(xì)胞接觸,從而啟動(dòng)上述凝血過(guò)程。所以,選擇TF作為靶向腫^茄苣諂は赴陌械憔哂辛己玫奶匾煨�。本课题组前浦J芯康腅GFP-EGF1蛋白具有TF特異性和高度的親和力,且將其連接于聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒(PLGA)納米粒表面后構(gòu)建的EGFP-EGF1-PLGA納米粒也具有TF靶向性。 光化學(xué)反應(yīng)能夠使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,引發(fā)血小板聚集,從而形成血栓。其發(fā)生機(jī)制為：特定波長(zhǎng)的光照射使血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的光敏劑受到激發(fā),此激發(fā)狀態(tài)下的光敏劑可以把能量傳遞給周圍的氧,生成高活性的單態(tài)氧,單態(tài)氧和細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等中的重要生物大分子(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等)發(fā)生氧化反應(yīng),從而啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而引起TF的釋放激活凝血瀑布,造成局部的血栓形成。在該光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中,光敏劑作為能量的載體和反應(yīng)的橋梁,發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ethe, HMME),是種成分單一、性能穩(wěn)定的新型光敏劑,其激發(fā)峰為395nm,發(fā)射峰為613nm。它能夠從體內(nèi)迅速清除,毒性明顯低于第一代光敏劑(血卟啉衍生物)。由于血卟啉單甲醚體內(nèi)注射后很快就被肝臟的枯否(Kupffer)細(xì)胞吞噬,其血液中的濃度會(huì)迅速下降,如果想造成肝臟以外的,身體其他目標(biāo)部位的梗塞,必須提高初始的給藥劑量。全身m藥濃度過(guò)高除造成肝臟損害外,還需要避光來(lái)防止日光照射產(chǎn)生活性氧對(duì)身體淺表部位的傷害。那么采用靶向給藥的方式可大大降低全身給藥劑量,既能在目標(biāo)部位形成較高濃度,又可以盡量減少正常部位藥物濃度,從而將藥物對(duì)正常組織的損傷降至最低。 由此,研究者設(shè)想：能否將血卟啉單甲醚包載在EGF1-EGFP-NP內(nèi)部,通過(guò)納米粒的TF靶向性運(yùn)載到高表達(dá)TF的腫瘤血管,然后針對(duì)瘤體采用冷光源照射,局部產(chǎn)生活性氧損傷血管內(nèi)皮可引起TF進(jìn)一步釋放,這樣既給TF靶向納米粒提供更多的靶標(biāo)募集更多的納米粒,也可通過(guò)這種瀑布效應(yīng)產(chǎn)生更多的TF促發(fā)進(jìn)一步凝血反應(yīng),從而特異性梗塞腫瘤血管。 鑒于以上基礎(chǔ),本研究將制備包載血卟啉單甲醚的EGF1-EGFP-NP,選取高表達(dá)TF的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)作為腫瘤血管內(nèi)皮模型,選取CA46淋巴瘤細(xì)胞復(fù)制動(dòng)物實(shí)體瘤模型,體內(nèi)及體外研究該納米粒在冷光源激發(fā)下,是否能靶向到高表達(dá)TF的腫瘤血管內(nèi)皮?是否能激發(fā)局部TF的進(jìn)一步釋放及載血卟啉單甲醚納米粒子的不斷聚集,導(dǎo)致局部的血栓形成?是否可中斷腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng),發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)?期望能為實(shí)體腫瘤的治療提供新的思路。 第一部分載血卟啉單甲醚的EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒的構(gòu)建及體外評(píng)價(jià)目的 將血卟啉單甲醚載入EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒中,并對(duì)該納米粒的理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定：驗(yàn)證HMME-ENP對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)的靶向性；評(píng)價(jià)在冷光源照射下HMME-ENP誘導(dǎo)BMECs產(chǎn)生活性氧和組織因子的作用。 方法 1)采用單乳法,合成出包載血卟啉單甲醚的PLGA納米粒(HMME-NP),之后將EGFP-EGF1蛋白巰基化,連接于HMME-NP表面,合成出MME-ENP;通過(guò)粒徑測(cè)定儀對(duì)納米粒的粒徑進(jìn)行測(cè)定；通過(guò)普通電鏡觀察納米粒的形態(tài),并通過(guò)BCA法測(cè)定納米粒的EGFP-EGF1蛋白連接效率；提取納米粒中的血卟啉單甲醚,計(jì)算血卟啉單甲醚的載藥量。 2)兩次消化加Percoll梯度離心法提取大鼠BMECs, TNFα上調(diào)BMECs TF的表達(dá),構(gòu)建體外血管損傷模型；在ENP納米粒表面連接香豆素-6示蹤納米粒,進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)；通過(guò)Dihydroethidium (DHE)超氧化物陰離子熒光探針檢測(cè)BMECs細(xì)胞光照后活性氧產(chǎn)生情況；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot,檢測(cè)BMECs細(xì)胞光照后TF表達(dá)水平的改變。 結(jié)果 1)載入血卟啉單甲醚的ENP (HMME-ENP)粒徑大小約110-120rnm左右,外觀大小均一、圓整。HMME-ENP納米粒表面EGFP-EGF1蛋白連接效率為39.27%。血卟啉單甲醚的載藥量約4.24ug/mg。 2)大鼠BMECs原代細(xì)胞存在TF的少量表達(dá),TNF (100ng/ml,6h)可以刺激細(xì)胞上調(diào)TF表達(dá)；細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示,連接有EGF1-EGFP蛋白的ENP比NP更利于細(xì)胞攝�。� 3)在冷光源照射下,HMME-ENP可以誘導(dǎo)BMECs細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和促進(jìn)TF表達(dá),且作用強(qiáng)于HMME-NP誘導(dǎo)的。 結(jié)論 1) HMME-ENP粒徑大小均一,EGFP-EGF1蛋白的成功連接,HMME的載藥量都可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求; 2) HMME-ENP體外血管損傷模型中具有TF靶向性： 3)在冷光源作用下,HMME-ENP納米粒中包載的HMME可以促進(jìn)活性氧產(chǎn)生及TF表達(dá)。 第二部分載血卟啉單甲醚的EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒在小鼠淋巴瘤皮下瘤模型中的評(píng)價(jià) 目的 構(gòu)建小鼠淋巴瘤的皮下瘤模型；用Dir示蹤MME-NP納米粒,在淋巴瘤皮下瘤模型中,進(jìn)一步驗(yàn)證其TF靶向性；初步評(píng)價(jià)冷光源照射下,MME-ENP對(duì)小鼠淋巴瘤的干預(yù)作用。 方法 1)以NOD/Scid小鼠為種瘤對(duì)象,挑選淋巴瘤細(xì)胞系CA46細(xì)胞以1*107的密度終種植在小鼠右側(cè)肩胛區(qū)皮下： 2)成瘤小鼠尾靜脈分別注射Dir標(biāo)記的HMME-ENP及HMME-NP,冷光源照射局部瘤體后給予活體成像,觀察2h、6h、12h、24h等各時(shí)間點(diǎn)納米粒在小鼠體內(nèi)的分布；24h點(diǎn)處死小鼠,取心、腦、肝臟、脾臟、腎、肺、瘤體等進(jìn)行器官成像,計(jì)算組織熒光強(qiáng)度； 3)免疫熒光檢測(cè)小鼠瘤體冰凍切片的活性氧和TF分布；HE染色檢測(cè)血栓；結(jié)果 1)CA46細(xì)胞種植3-4周后,80%以上NOD/Scid小鼠均可見(jiàn)瘤細(xì)胞種植部位皮下瘤的形成； 2)活體成像結(jié)果顯示：a)在2h、6h、12h、24h等各時(shí)間點(diǎn),尾靜脈注射ENP的小鼠瘤體處納米粒聚集均強(qiáng)于注射NP小鼠；給予光照后,尾靜脈注射ENP的納米粒聚集仍強(qiáng)于NP聚集; b)給予光照后,尾靜脈注射ENP的納米粒聚集強(qiáng)于未光照組ENP聚集;光照后尾靜脈注射NP的納米粒聚集強(qiáng)于未光照組NP聚集； c)給予光照后,尾靜脈注射ENP的納米粒聚集在2h、6h、12h、24h等所有時(shí)間點(diǎn)中,6h達(dá)最高。 3)器官成像顯示：a)24h點(diǎn)納米粒在肝臟的聚集最多,其次為脾臟、瘤體;b)余結(jié)果與上述活體成像吻合； 4)瘤體冰凍切片免疫熒光顯示納米粒聚集的部位與TF表達(dá)區(qū)域吻合： 5)注射ENP的小鼠瘤體活性氧、血栓及TF表達(dá)等均較注射NP的。 結(jié)論 1)ENP在小鼠淋巴瘤皮下瘤模型中具有靶向性; 2)在冷光源局部照射下,HMME-ENP可以促進(jìn)瘤體產(chǎn)生更多的活性氧、TF、和血栓,有望為腫瘤靶向治療提供一個(gè)新的策略。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.1

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本文編號(hào)：2674454