發(fā)布時間：2020-05-17 14:25

【摘要】：噬菌體展示技術是一種功能強大的分子文庫展示技術,可針對特定的靶標有效地篩選出特異性的多肽或蛋白分子。由于多肽分子具有分子量小、易合成修飾、生物免疫原性低等優(yōu)點,因此多肽作為一種生物識別分子被廣泛應用于生物醫(yī)學領域。常見的生物識別分子,如抗體雖然親和力高、特異性好,但分子量大、提取方法復雜,核酸適體雖然靈活性高,但其二級結構和結合效果易受周圍環(huán)境的影響,因此多肽作為生物識別分子具有獨特的優(yōu)勢。目前腫瘤相關問題是人們關注的熱點,腫瘤標志物作為一種與腫瘤的發(fā)生密切相關的生物標志物,常用于腫瘤的診斷、監(jiān)測和預后,因此以腫瘤標志物為靶標篩選出特異性的多肽識別分子具有重要意義。傳統(tǒng)的噬菌體展示技術主要是將靶標固定在固相載體上,經(jīng)過多輪淘選以獲得具有結合能力的噬菌體克隆,雖然該技術能有效地篩選出具有特異性親和能力的多肽,但是篩選過程中存在文庫易偏向性擴增、易交叉污染、單克隆的挑取和驗證步驟繁瑣等問題,因此如何發(fā)展出快速、高效、簡單的篩選新方法是目前噬菌體展示技術亟待解決的一個重要問題。本論文以發(fā)展噬菌體展示技術新方法及其應用為研究目標,結合微流控技術,建立快速、高效、高通量、自動化的噬菌體展示技術新平臺。本工作主要展開了以下兩個工作:(1)利用傳統(tǒng)的噬菌體展示技術以腫瘤標志物為靶標進行篩選,并篩選得到了對應的特異性結合多肽。分別針對蛋白CD71和c-Met篩選得到了具有特異性的識別多肽,并模擬了其二級結構,為了考察這些多肽分子的結合能力,對其結合能力、特異性以及對腫瘤細胞的識別能力進行了分析。(2)結合微流控芯片試劑消耗量少、通量高、易集成等優(yōu)勢,建立了基于液滴微流控噬菌體展示技術新方法。根據(jù)微流控相關理論,設計了一種具有螺旋結構的雙入口十字交叉芯片,用于液滴的生成。以CD71為靶標,先在芯片外對噬菌體文庫進行預富集,再對預富集的文庫實現(xiàn)芯片上的篩選。利用微流控液滴生成技術,將單個分散的噬菌體和包被了靶標的微球一起包裹到微液滴中,利用液滴中的宿主菌對噬菌體進行大量擴增實現(xiàn)信號放大,當融合噬菌體與靶標具有結合能力時噬菌體可以結合到微球表面,最后破乳收集微球并對噬菌體核酸染色,熒光顯微鏡下挑取微球直接獲得具有結合能力的單克隆。通過該方法最后獲得了具有特異性結合能力的多肽,并進一步對這些多肽的結合能力進行了分析考察。這種篩選新方法具有液滴生成快速、通量高、試劑消耗少的優(yōu)點,還降低了交叉污染的風險,提高了篩選效率。
【圖文】：

蛋白質(zhì)外殼和環(huán)狀申鏈ＤＮＡ組成，全基因組共有１１個基因，其中５個基因編逡逑碼衣殼蛋白，分別是ｐ３、ｐ６、ｐ７、ｐ８和ｐ９蛋白，基于這些衣殼蛋白位點可以構逡逑建多種外源多肽或蛋白展示的方法［３３］，如

圖１．３噬菌體介導的裸眼定量檢測［４３］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐｈａｇｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｃｏｕｎｔｉｎｇ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ邋ｂｙ邋ｎａｋｅ邋ｅｙｅ［４３］逡逑噬菌體的尺寸在納米級別，而且形狀大小均一，使其在一些基于材料的牛物逡逑傳感器方面也有較好的應川。Ｓｃｕｎｇ－Ｗｕｋ邋Ｌｅｅ課題組［４４］從火雞皮膚顏色的變化獲逡逑得靈感，模擬火雞皮膚內(nèi)膠原束納米結構，發(fā)展了基于噬菌體自組裝［４５］的納米逡逑結構牛物傳感器，該傳感器可以檢測濕度變化和揮發(fā)性有機物質(zhì)，并進一步利；］］逡逑噬菌體可展示外多肽的性質(zhì)實現(xiàn)了邋ＴＮＴ等分子的靈敏檢測。通過在噬菌體衣殼逡逑蛋白融合表達ＴＮＴ特異性結合多肽，使噬菌體納米傳感器可以特異性識別ＴＮＴ，，逡逑ＴＮＴ與噬菌體表面多肽的結合會導致噬菌體納米束的迅速膨脹或收縮，由于光逡逑的相干散射原理，傳感器發(fā)生明顯的顏色變化，由此輕松實現(xiàn)靶分子的快速靈敏逡逑檢測。這種基于噬菌體展示的牛物傳感器能特異性識別Ｋ分ＴＮＴ和它的類似物，逡逑檢測靈敏度低至３００邋ｐｐｂ．的ＴＮＴ，具有高靈敏度和高特異性識別能力，這種快速、逡逑
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.4

【參考文獻】

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1 Xiaohua Guo;Chuncheng Niu;Yunhua Wu;Xiaosheng Liang;;Application of an M13 bacteriophage displaying tyrosine on the surface for detection of Fe~(3+) and Fe~(2+) ions[J];Virologica Sinica;2015年06期

本文編號：2668697