【摘要】：據(jù)統(tǒng)計(jì),在世界范圍內(nèi),肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在常見惡性腫瘤的發(fā)病率排名第六位,在因惡性腫瘤原因致死的病例中排名第三位,于此同時,其發(fā)病率也在逐年上升。在我國,因?yàn)橛袨閿?shù)眾多的乙肝患者,所以HCC在惡性腫瘤的發(fā)病率中排名第二位。同時值得注意的是,因?yàn)閰^(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展不平衡,部分欠發(fā)達(dá)地區(qū)衛(wèi)生情況落后,所以HCC的實(shí)際發(fā)病率和死亡率可能會高于所報(bào)道的數(shù)據(jù)。盡管醫(yī)學(xué)研究在不斷的進(jìn)展,但HCC的早期診斷手段仍存在不足,大多數(shù)患者在其發(fā)病的中后期才確定診斷。即使如此,在對于獲得早期診斷的患者來說,治療手段仍然欠完善,經(jīng)治療后的長期生存率并未得到很大改善。伴隨著生物醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展,越來越多的基礎(chǔ)研究聚焦到HCC的診療上來,并且取得了一系列的成果。盡管現(xiàn)在對于HCC的生物學(xué)發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未研究透徹,但也為其今后的診療奠定了一定的基礎(chǔ)。細(xì)胞依靠多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來面對應(yīng)激反應(yīng),泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)是其中的一個重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變基因(Ataxia telangiectasia-mutated,ATM)和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張以及 Rad3 相關(guān)基因(Ataxia telangiectasia-mutated and Rad-3 related,ATR)是UPS系統(tǒng)中的兩個關(guān)鍵激酶。在近期的一些研究中發(fā)現(xiàn),環(huán)指和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 3(Ring finger and WD repeat domain 3,RFWD3)參與到了ATM/ATR通路應(yīng)對DNA損傷修復(fù)。RFWD3作為ATM/ATR的磷酸化底物,作用于多重賴氨酸殘基來參與到這個過程。此外還有文獻(xiàn)報(bào)道,在DNA損傷發(fā)生后,RFWD3在被停止的復(fù)制叉處積累,與復(fù)制蛋白A(replicationproteinA,RPA)共同定位,并通過其WD40域在c端與RPA相結(jié)合,并在同源重組(homologous recombination,HR)之后促進(jìn)復(fù)制叉的重新啟動。目前尚未有RFWD3在HCC中的文獻(xiàn)報(bào)告,其表達(dá)情況與HCC患者預(yù)后的關(guān)系,以及可能的機(jī)制也尚不清楚。值得注意的是,所有已知的包含E3結(jié)構(gòu)域的配體大部分是p53的負(fù)調(diào)控因子,通過促進(jìn)p53降解,抑制了對DNA損傷的反應(yīng)。但在目前的文獻(xiàn)中,擁有E3結(jié)構(gòu)域的RFWD3能維持P53的穩(wěn)定性,從而被認(rèn)為是一種抑癌基因。而且在初期的小樣本HCC篩查實(shí)驗(yàn)中,本研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組相比,HCC組的RFWD3基因表達(dá)水平普遍升高。結(jié)合以上信息,RFWD3在HCC中具體扮演了什么角色,參與了什么進(jìn)程,其內(nèi)在機(jī)制是什么,是一系列需要深入研究闡述的問題。本課題擬從以下四個部分進(jìn)行研究:第一部分通過臨床標(biāo)本檢測了 HCC和癌旁中RFWD3的表達(dá),結(jié)合相關(guān)臨床數(shù)據(jù)分析其在HCC中所起到的作用;在第二部分通過構(gòu)建慢病毒沉默下的RFWD3穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系,在體外實(shí)驗(yàn)中研究其細(xì)胞表型的影響;在第三部分通過構(gòu)建裸鼠體內(nèi)荷瘤模型,與體外實(shí)驗(yàn)相對應(yīng),進(jìn)一步驗(yàn)證其在生物學(xué)行為的影響;在第四部分通過運(yùn)用基因芯片和抗體芯片技術(shù)進(jìn)行RFWD3在HCC中的可能分子生物學(xué)機(jī)制探索。最終論證RFWD3蛋白作為肝癌分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)的可能性,為進(jìn)一步的基礎(chǔ)以及臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。第一部分RFWD3在肝癌組織中的表達(dá)與患者臨床指標(biāo)以及預(yù)后的相關(guān)性分析目的:通過臨床標(biāo)本檢測了 HCC和癌旁中RFWD3的表達(dá),結(jié)合相關(guān)臨床數(shù)據(jù)分析其在HCC中所起到的作用。方法:1.通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)對57例HCC患者的癌和癌旁組織中RFWD3的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測。2.通過蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB),從上述57例HCC患者樣本中,隨機(jī)抽取16對組織樣本(HCC及鄰近的正常肝組織)進(jìn)行RFWD3在HCC和癌旁組織中蛋白表達(dá)的檢測。3.通過免疫組化(Immunohistochemical,IHC)法,從上述57例HCC患者樣本中,以是否及時福爾馬林保存并進(jìn)行蠟塊包埋為選擇標(biāo)準(zhǔn),最終選取32對組織樣本(HCC及鄰近的癌旁肝組織)進(jìn)行RFWD3蛋白表達(dá)的檢測,結(jié)合相關(guān)臨床數(shù)據(jù)分析其與HCC之間的關(guān)系。4.為擴(kuò)大樣本量,減少抽樣誤差從而保證推算結(jié)果的精確度和可靠性,本研究還運(yùn)用了 GEPIA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)作為補(bǔ)充驗(yàn)證,用于進(jìn)行RFWD3表達(dá)和相關(guān)生存分析。結(jié)果:1.通過qRT-PCR,WB以及IHC檢測發(fā)現(xiàn),HCC組織中的RFWD3表達(dá)顯著升高(P0.05)。2.IHC結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),RFWD3的高表達(dá)情況與腫瘤體積較大和TNM分期較差顯著相關(guān)(P0.05)。3.生存分析發(fā)現(xiàn),RFWD3的高表達(dá)患者擁有更短的總生存期,提示RFWD3在肝癌進(jìn)展過程中可能發(fā)揮了重要促進(jìn)作用(P0.05)。第二部分體外RFWD3基因沉默表達(dá)后對HCC細(xì)胞表型的影響目的:構(gòu)建在慢病毒沉默下的RFWD3穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系,并通過體外實(shí)驗(yàn)來研究其細(xì)胞表型的影響方法:1.驗(yàn)證肝癌細(xì)胞系 BEL-7404,HCC-LM3,BEL-7402 和 SMMC-7721 的RFWD3表達(dá)豐度。2.構(gòu)建在慢病毒沉默下的RFWD3穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系(對照組:shCtrl;沉默組:shRNAi)。3.利用qRT-PCR,WB和熒光成像系統(tǒng)驗(yàn)證shRNAi沉默效率。4.MTT法檢測shRNAi后對其增值能力的影響。5.流式細(xì)胞儀檢測shRNAi后對其細(xì)胞周期狀態(tài)的影響。6.流式細(xì)胞儀檢測shRNAi后對其凋亡狀態(tài)的影響。7.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測shRNAi后對其遷移能力的影響。8.Transwell法檢測shRNAi后對其遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果:1.qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),RFWD3在四種HCC細(xì)胞系中均穩(wěn)定表達(dá),其中BEL-7404 和 HCC-LM3 表達(dá)豐度最高(△cT6)。2.慢病毒轉(zhuǎn)染后,RFWD3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。3.shRNAi后,細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期,凋亡率上升,細(xì)胞的增殖情況受到抑制(P0.05)。4.shRNAi后,侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降(P0.05)。第三部分體內(nèi)RFWD3基因沉默表達(dá)后對HCC生物學(xué)行為的影響目的:構(gòu)建在慢病毒沉默下的RFWD3穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系,并通過體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)來研究其生物學(xué)行為的影響。方法:1.s RNAi細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下HCC成瘤模型。2.s RNAi細(xì)胞構(gòu)建裸鼠尾靜脈注射HCC肺轉(zhuǎn)移模型。3.利用影像學(xué)以及HE染色等方法,檢測其生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:1.裸鼠皮下HCC成瘤模型中,shRNAi組腫瘤體積明顯減小(P0.05)。2.裸鼠尾靜脈注射HCC肺轉(zhuǎn)移模型中,shRNAi組肺部體積無明顯增大,腫瘤明顯減少(P0.05)。3.裸鼠尾靜脈注射HCC肺轉(zhuǎn)移模型中,HE染色證實(shí)shRNAi組肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和體積均明顯減少(P0.05)。第四部分RFWD3在HCC中的分子生物學(xué)機(jī)制研究目的:運(yùn)用基因芯片和抗體芯片技術(shù),進(jìn)行RFWD3在HCC中的可能分子生物學(xué)機(jī)制探索,論證RFWD3蛋白作為肝癌分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)的可能性,為進(jìn)一步的基礎(chǔ)以及臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。方法:1.運(yùn)用蛋白抗體芯片檢測shRNAi后Stress and Apoptosis信號通路中相關(guān)基因表達(dá)情況。2.運(yùn)用基因表達(dá)芯片檢測shRNAi后基因表達(dá)譜改變情況。3.利用IPA分析相關(guān)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:1.蛋白抗體芯片檢測StressandApoptosis信號通路中相關(guān)基因,其通路中IkB α(Total),Survivin 和 α-Tubulin 蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào),P44/42 MAPK(ERK1/2),HSP27,p53,SAPK/JNK,Chk1,Chk2,IkB α(Ser32/36),eIF2α和TAK1蛋白磷酸化水平顯著下調(diào)(P0.01)。2.經(jīng)篩選,基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)顯示有454個基因mRNA表達(dá)有明顯改變(above 2-fold,P0.05)。3.IPA分析發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞生存以及凋亡,細(xì)胞運(yùn)動和侵襲,細(xì)胞裝配以及DNA復(fù)制、重組和修復(fù)等相關(guān)性基因方面有明顯富集情況。而且IPA分析表明,Wnt/β-catenin以及TGF-β signalling信號通路也有明顯改變(P0.05)。全文結(jié)論1.RFWD3基因在肝癌中表達(dá)升高,并和腫瘤大小以及TNM分期密切相關(guān),RFWD3低表達(dá)的HCC患者生存時間高于RFWD3高表達(dá)患者。2.沉默RFWD3后,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HCC細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期,凋亡率上升,增殖被抑制。此外HCC細(xì)胞的侵襲以及轉(zhuǎn)移能力顯著下降。3.沉默RFWD3后,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)肝癌細(xì)胞的生長,侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降。4.RFWD3通過調(diào)控MAPK、Wnt/β-catenin以及TGF-β基因通路來影響HCC的腫瘤發(fā)展進(jìn)程。
【圖文】：

２．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測各樣品中ＲＦＷＤ３的蛋白表達(dá)逡逑運(yùn)用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ對１６例ＨＣＣ以及癌旁肝臟組織樣本中的ＲＦＷＤ３蛋白表逡逑達(dá)量進(jìn)行檢測并進(jìn)行灰度值分析，結(jié)果如圖１．２所示，ＲＦＷＤ３蛋白在ＨＣＣ中的逡逑表達(dá)明顯氋于癌旁正常肝臟組織中的表達(dá)，其差異值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝逡逑０．０１０５）0逡逑Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ逡逑ＲＦＷ［）３邋？邋？邋＿逡逑ＧＡＰＤＨ邋—邋一一一一邋—邋一—逡逑ＲＦＷＤ３邋卜－邐一＇＿＾邐＿逡逑ＧＡＰＤＩｌ邋ｔｔｍａｍ邋ｍｍｍ邋ｍｍｍ邋ｍｍｍｍ邋ｍａｍ邋ｍｍｍｍ邋ｍｍｍｒｎ邋ｍｍｍ逡逑ｘ１５ｌ逡逑ｓ逡逑Ｓ邋１０－逡逑Ｑ逡逑ｇ邋Ｉ邐＊＊逡逑ｏ逡逑ＴＯ逡逑00ｊ邋邐，邐邐邐—ｎ—＊—逡逑Ｔｕｍｏｒ邐Ｎｏｎ－Ｔｕｍｏｒ逡逑圖１．２邋１６例ＨＣＣ組織與癌旁組織的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｏｌｔ結(jié)果證實(shí)ＲＦＷＤ３在ＨＣＣ組織中的表達(dá)水逡逑平顯著高于癌旁組織（Ｐ邋＝邋０．０１０５）逡逑１６逡逑

邐Ｎｏｎ－Ｔｕｍｏｒ逡逑ｎ＝５４逡逑圖１．１邋５４對ＨＣＣ組織與癌旁組織的ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果證實(shí)ＲＦＷＤ３在ＨＣＣ組織中的表達(dá)水平逡逑顯著高于癌旁組織（尸＜０．００１）逡逑２．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測各樣品中ＲＦＷＤ３的蛋白表達(dá)逡逑運(yùn)用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ對１６例ＨＣＣ以及癌旁肝臟組織樣本中的ＲＦＷＤ３蛋白表逡逑達(dá)量進(jìn)行檢測并進(jìn)行灰度值分析，，結(jié)果如圖１．２所示，ＲＦＷＤ３蛋白在ＨＣＣ中的逡逑表達(dá)明顯氋于癌旁正常肝臟組織中的表達(dá)，其差異值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝逡逑０．０１０５）0逡逑Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ逡逑ＲＦＷ［）３邋？邋？邋＿逡逑ＧＡＰＤＨ邋—邋一一一一邋—邋一—逡逑ＲＦＷＤ３邋卜－邐一＇＿＾邐＿逡逑ＧＡＰＤＩｌ邋ｔｔｍａｍ邋ｍｍｍ邋ｍｍｍ邋ｍｍｍｍ邋ｍａｍ邋ｍｍｍｍ邋ｍｍｍｒｎ邋ｍｍｍ逡逑ｘ１５ｌ逡逑ｓ逡逑Ｓ邋１０－逡逑Ｑ逡逑ｇ邋Ｉ邐＊＊逡逑ｏ逡逑ＴＯ逡逑00ｊ邋邐，邐邐邐—ｎ—＊—逡逑Ｔｕｍｏｒ邐Ｎｏｎ－Ｔｕｍｏｒ逡逑圖１．２邋１６例ＨＣＣ組織與癌旁組織的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｏｌｔ結(jié)果證實(shí)Ｒ
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2668032