發(fā)布時間：2020-05-15 23:56

【摘要】：涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma,SACC)臨床最常見的涎腺高發(fā)惡性腫瘤之一,具有嗜神經(jīng)侵襲和高血行轉移低淋巴結轉移這兩個顯著的臨床特點,肺是最常見SACC血行轉移的靶器官。而其高血行轉移是導致腫瘤復發(fā)和患者不良預后的重要原因,也是研究關注的焦點問題。腫瘤中血管的生成在腫瘤發(fā)展和轉移的過程中起到了至關重要的作用。腫瘤中的血管是腫瘤細胞所需營養(yǎng)的輸送渠道,也是腫瘤細胞轉移的重要渠道,腫瘤中血管生成能力和微血管密度(micro vessels density,MVD)與腫瘤的血行轉移正相關。Neuropilin蛋白家族是一類與腫瘤血管/淋巴管生成密切相關的跨膜細胞受體,不僅參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為,其成員NRP1和NRP2分別參與調(diào)節(jié)腫瘤中血管或淋巴管的生成。但是,在SACC中,是否存在由于NRP1和NRP2表達差異而導致的血管淋巴管生成差異,進而導致SACC出現(xiàn)高血行轉移低淋巴結轉移的臨床特點,未見報道。從2008年開始,普萘洛爾被發(fā)現(xiàn)具有抑制血管生成的作用,被用作臨床治療嬰幼兒血管瘤的一線藥物,具有安全性高,經(jīng)濟性好的特點。目前,也有少量有關普萘洛爾對某些腫瘤細胞作用的研究,提示,在體外,普萘洛爾可以抑制某些腫瘤細胞系,如胰腺癌等,細胞的增殖,促進其凋亡,但普萘洛爾對SACC是否具有上述效果未見報道。綜上所述,本課題源自涎腺腺樣囊性癌血行轉移率高淋巴結轉移率低這一臨床特點,在正常涎腺組織(normal salivary gland,NSG)、口腔鱗狀細胞癌組織(oral squamous cell carcinoma,OSCC)、發(fā)生血行轉移SACC(metastatic SACC)以及未發(fā)生血行轉移SACC(non-metastatic SACC)中對比研究NRP1、NRP2及其配體VEGF-A等與血管生成相關細胞因子的表達,微血管密度、微淋巴管密度(micro lymphatic vessels density,LVD)與蛋白表達和SACC血行轉移的關系;研究普萘洛爾對SACC細胞的抑制作用以及對血管生成相關因子表達的抑制作用,為臨床治療SACC血行轉移提供新的治療策略和實驗研究基礎。研究目的:1、研究NRP1、NRP2及其配體VEGF-A等蛋白在正常涎腺組織、口腔鱗狀細胞癌組織、發(fā)生血行轉移SACC以及未發(fā)生血行轉移SACC中的表達水平差異;研究上述組織中MVD和LVD的差異,并對NRP1及其配體VEGF-A等的表達強度與SACC組織和正常涎腺組織中MVD的關系進行了相關性分析研究。2、利用人涎腺腺樣囊性癌細胞系SACC-83和人涎腺腺樣囊性癌肺轉移細胞系SACC-LM,研究普萘洛爾對SACC細胞中NRP1、VEGF-A等血管生成相關因子和MMP-2以及MMP-9等與腫瘤細胞侵襲遷移運動相關因子的抑制作用;研究普萘洛爾對SACC細胞在遷移、侵襲等與轉移相關的細胞生物學行為的影響;動物實驗在體內(nèi)研究普萘洛爾對SACC血行肺轉移的影響。3、研究普萘洛爾對SACC-83和SACC-LM這兩種SACC腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期和細胞自噬的影響;動物實驗在體內(nèi)研究普萘洛爾對SACC腫瘤形成和增殖的影響及對腫瘤內(nèi)血管生成的影響。研究方法:1、收集正常涎腺組織、口腔鱗狀細胞癌組織、發(fā)生血行轉移SACC以及未發(fā)生血行轉移SACC組織標本各30例,通過免疫組織化學染色和光密度法(mean IOD),觀察對比NRP1、NRP2及其配體VEGF-A、Sema-3A和Sema-3F等蛋白在不同組織間的表達水平的差異;利用血管和淋巴管內(nèi)皮標志物,對上述組織中的MVD和LVD進行計數(shù)統(tǒng)計;單因素方差分析用于研究不同組間蛋白表達的差異和組間MVD、LVD的差異;相關性檢驗用于研究MVD與目標蛋白表達之間的相互關系,綜合所得結果分析SACC高血行轉移可能的原因。2、對正常涎腺組織和SACC組織中β腎上腺素能受體進行免疫組織化學染色分析,主要研究其在SACC組織中的分布情況。研究不同濃度的普萘洛爾作用于SACC-83和SACC-LM細胞后,通過western blot實驗研究細胞中NRP1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9等與血管生成和細胞遷移侵襲相關的蛋白的表達變化;ELISA實驗研究普萘洛爾對SACC腫瘤細胞分泌VEGF-A能力的影響;細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗研究細胞遷移、侵襲能力的變化;利用人涎腺腺樣囊性癌肺轉移細胞系SACC-LM建立裸鼠SACC肺轉移動物模型,研究普萘洛爾對SACC經(jīng)血行肺轉移的抑制作用。3、通過MTT實驗研究普萘洛爾對SACC-83和SACC-LM細胞增殖能力的影響;流式細胞技術研究普萘洛爾對SACC-83和SACC-LM細胞凋亡和周期的影響;western blot實驗觀察普萘洛爾作用后細胞中自噬標志物的表達水平變化,研究普萘洛爾對細胞自噬的影響;利用SACC-LM細胞建立SACC裸鼠皮下移植瘤動物模型,研究在體內(nèi)環(huán)境下普萘洛爾對SACC移植瘤形成及增殖的抑制作用,以及對腫瘤內(nèi)血管生成的抑制作用。實驗結果:1、在NSG、SACC、OSCC組織中,NRP1的NRP2表達具有明顯差異:NRP1在SACC、OSCC在NSG中表達水平依次降低;NRP2在OSCC中表達最高,在NSG和SACC中無差別。MVD在SACC、OSCC和NSG中依次減少(p0.001)。OSCC中LVD最高,在NSG和SACC中LVD無差別。在轉移SACC、未轉移SACC和NSG中,NRP1、VEGF-A表達水平依次降低;NRP2的表達在三種組織間無差別;Sema-3A和Sema-3F的表達在三種組織間依次升高。MVD在轉移SACC、未轉移SACC和NSG中依次降低,組間差別具有統(tǒng)計學意義;LVD在三種組織間無差別。NRP1和VEGF-A在SACC-LM中表達均較SACC-83升高;而NRP2在SACC-LM中表達較SACC-83沒有差別,無統(tǒng)計學意義。2、普萘洛爾作用于SACC-83和SACC-LM細胞后,兩種細胞中的NRP1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9表達隨藥物濃度的上升均下降,并且腫瘤細胞分泌VEGF-A的水平也有下降;細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結果證明,SACC細胞的遷移和侵襲能力隨普萘洛爾濃度的升高而降低;裸鼠肺轉移實驗結果發(fā)現(xiàn),普萘洛爾作用組中,SACC肺轉移的轉移灶少,且轉移灶的體積也較小,證明普萘洛爾可以抑制SACC細胞的經(jīng)血行肺轉移。3、普萘洛爾作用于SACC-83和SACC-LM細胞后,兩種細胞的增殖隨藥物濃度的上升和作用時間的延長受到明顯的抑制;細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)普萘洛爾作用后,兩種細胞S期延長,G0/G1期縮短,符合增殖抑制的表現(xiàn)。普萘洛爾作用后均促進了SACC-83和SACC-LM細胞的凋亡和自噬,作用效果與藥物濃度和作用時間正相關。動物實驗發(fā)現(xiàn),普萘洛爾作用后,SACC移植瘤重量顯著小于對照組。進一步研究發(fā)現(xiàn),在移植瘤中,普萘洛爾作用組MVD雖然與對照組MVD沒有差別,但普萘洛爾作用組的血管直徑要明顯小于對照組,且差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結論:涎腺腺樣囊性癌中NRP1和VEGF-A的表達升高導致了血管生成的增加,為其血行轉移提供了必要條件;NRP2的低水平表達抑制了腫瘤中淋巴管的生成,阻斷了腫瘤沿淋巴管轉移的通道,降低了腫瘤發(fā)生淋巴結轉移的可能。上述原因可能是導致涎腺腺樣囊性癌高血行轉移低淋巴轉移的原因之一。普萘洛爾可以通過抑制SACC細胞表面NRP1的表達以及腫瘤細胞中VEGF-A的合成與分泌,抑制SACC組織中新生血管的形成和發(fā)育,并通過抑制SACC細胞中MMP-2和MMP-9的表達,抑制了腫瘤細胞的運動和侵襲能力,同時,普萘洛爾還具有停滯腫瘤細胞周期、促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡和自噬,從而抑制細胞增殖的能力。綜上所述,對于SACC,普萘洛爾從腫瘤中血管生成和腫瘤增殖及運動等多方面抑制了SACC的發(fā)展和血行轉移。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.8

【參考文獻】

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