【摘要】：前言:胰腺癌是一種較常見的惡性腫瘤,近年來(lái)發(fā)病率有顯升高的趨勢(shì),病理類型大多為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞腺癌,由于胰腺解剖位置深及腫瘤易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和向周圍侵襲,一旦確診多屬于晚期,預(yù)后及其不佳。盡管早期胰腺癌可行胰十二指腸切除術(shù),但多數(shù)病人確診時(shí)已不適合手術(shù),5年中位生存率低于7%。即使結(jié)合化療等綜合治療,治療效果仍不理想。所以探索新的有效的靶點(diǎn),研究致癌、促癌相關(guān)機(jī)制對(duì)治療胰腺癌,改善其預(yù)后具有重大現(xiàn)實(shí)意義。FOXL1是插頭蛋白/翼旋轉(zhuǎn)盒子家族轉(zhuǎn)錄因子。包含F(xiàn)OXA到FOXR。FOX在許多生理或病理過程中起到了關(guān)鍵作用,比如成為腫瘤促進(jìn)或抑制因子。特別是FOXM1被認(rèn)為在胰腺癌中是腫瘤基因,且與預(yù)后不良有關(guān)。FOXL1最近被認(rèn)為是胰腺癌抑制因子,與胰腺癌患者生存時(shí)間正相關(guān)。PP2A是一個(gè)大的寡聚蛋白質(zhì)包括絲氨酸和蘇氨酸磷酸酶,在真核細(xì)胞中占據(jù)了磷酸酶的多數(shù)。PP2A是關(guān)鍵的腫瘤抑制因子,通過控制一系列細(xì)胞生理過程負(fù)向調(diào)控多種對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號(hào)通路(MAPK/ERK、NF-kB和C-MYC通路)。PP2A抑制蛋白CIP2A,與胰腺癌患者生存時(shí)間負(fù)相關(guān)。PP2A通過抑制C-MYC蛋白62號(hào)位點(diǎn)絲氨酸磷酸化,誘導(dǎo)C-MYC泛素化降解進(jìn)而抑制其腫瘤活性,延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間。但二種抑癌基因同時(shí)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,是否存在協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用尚未見報(bào)道,其機(jī)制也不清楚。目的:構(gòu)建PANC-1細(xì)胞FOXL1和PP2A聯(lián)合同時(shí)表達(dá)腺病毒模型,研究FOXL1和PP2A在PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后含量的動(dòng)態(tài)變化;檢驗(yàn)FOXL1和PP2A聯(lián)合同時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖、遷移能力和凋亡的影響;檢驗(yàn)FOXL1和PP2A聯(lián)合同時(shí)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性的變化;探索FOXL1和PP2A聯(lián)合同時(shí)轉(zhuǎn)染協(xié)同促進(jìn)PANC-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制。研究方法:使用腺病毒構(gòu)建FOXL1和PP2A共表達(dá)載體,分為Ad(CON)、Ad(FOXL1)、Ad(PP2A)和Ad(FOXL1+PP2A)組。用免疫印記(Western blot)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)四組細(xì)胞中FOXL1和PP2A表達(dá),并檢測(cè)下游蛋白TRAIL、MYC、CLEAVED-CASPASE3、Lyzed-PARP的表達(dá)。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)四組細(xì)胞0、3、5、7天后細(xì)胞增殖情況,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)四組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力,使用流式細(xì)胞儀及CASPASE3熒光試劑盒檢測(cè)四組細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。使用t檢驗(yàn)、方差分析檢測(cè)四組細(xì)胞經(jīng)過不同處理的差異性。結(jié)果:Ad(FOXL1)組和Ad(FOXL1+PP2A)組PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,FOXL1的mRNA和蛋白水平顯著提高(P0.001,P0.001),Ad(PP2A)組與Ad(CON)比無(wú)顯著差異,PP2A的mRNA和蛋白在Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組顯著高于對(duì)照組(P0.001,P0.0001),Ad(FOXL1)組與Ad(CON)相比無(wú)顯著差異。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染腺病毒5或7天后,Ad(FOXL1+PP2A)組PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與對(duì)照組相比降低(P0.05 for 5 D.P.I.,or P0.01 for 7 D.P.I.)。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)證明Ad(FOXL1)組,Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組形成較少的細(xì)胞群落(P0.05,P0.01 or P0.001),四組間細(xì)胞克隆大小存在顯著差異(P0.01,P0.01,P0.01)。Ad(FOXL1)組,Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組中的克隆群落明顯小于Ad(CON)組。轉(zhuǎn)染3 MOI病毒后,Ad(FOXL1)組,Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組與Ad(CON)相比PANC-1細(xì)胞遷移顯著減少(P0.01,P0.01,P0.001)。給予10μM 5-FU,檢測(cè)Ad(CON)組,Ad(FOXL1)組,Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組PANC-1細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性,Ad(FOXL1)組,Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組細(xì)胞與Ad(CON)相比存活率明顯下降(P0.05,P0.01,P0.05)。Ad(FOXL1)組,Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組較Ad(CON)組CLAVED-CASPASE3表達(dá)升高(P0.05;P0.05;P0.001),CASPASE3活性升高(P0.05,P0.01 or P0.001)。在PANC-1細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染3 MOI Ad(FOXL1)組和Ad(FOXL1+PP2A)組,TRAIL的mRNA水平顯著上調(diào)(P0.01,P0.01),轉(zhuǎn)染Ad(CON)組和Ad(PP2A)組,無(wú)顯著差異。MYC的m RNA水平經(jīng)上述病毒轉(zhuǎn)染各組均無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)染3 MOI Ad(FOXL1)組和Ad(FOXL1+PP2A)組TRAIL的蛋白水平明顯上升(P0.01,P0.01),各組中MYC的蛋白水平無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)染Ad(PP2A)組和Ad(FOXL1+PP2A)組,MYC磷酸化(S62)水平受到顯著抑制(P0.05)。結(jié)論:1、成功構(gòu)建PANC-1細(xì)胞FOXL1和PP2A聯(lián)合過表達(dá)模型,PANC-1細(xì)胞內(nèi)FOXL1和PP2A表達(dá)明顯增高。2、FOXL1和PP2A聯(lián)合同時(shí)轉(zhuǎn)染協(xié)同抑制胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞PANC-1增殖和遷移。3、FOXL1和PP2A聯(lián)合同時(shí)轉(zhuǎn)染提高PANC-1細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性,增加細(xì)胞凋亡。4、FOXL1和PP2A聯(lián)合同時(shí)轉(zhuǎn)染通過增加TRAIL蛋白表達(dá),抑制p-MYC(S62)表達(dá)協(xié)同疊加促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

8圖 1A FOXL1 和 PP2A 聯(lián)合同時(shí)表達(dá)的“2A”自切序列腺病毒示意圖。FOXL1 和 PP2A DNA 片段連接于腺病毒 DNA 中，共同轉(zhuǎn)錄形成 FOXL1-2A -PP2A mRNA后參與轉(zhuǎn)錄后翻譯，并在蛋白水平分裂成連個(gè)蛋白，形成同時(shí)表達(dá)兩個(gè)蛋白的效果。FOXL1 和 PP2A 序列通過 2A”自切序列連接，利用 PCR 技術(shù)，從合成的模板質(zhì)粒中提取目的基因，通過雙酶切，連接到 pShuttle-CMV 重組穿梭載體中后，形成病毒(PCMV)，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以在蛋白水平上實(shí)現(xiàn) FOXL1、PP2A、FOXL 1+PP2A 的高表達(dá)。注：Ad (CON) ( EGFP 過表達(dá))、Ad (FOXL1) ( FOXL1 過表達(dá))、Ad (PP2A) ( PP2A 過表達(dá))和Ad (FOXL1+PP2A) (FOXL1 和 PP2A 聯(lián)合過表達(dá))。

1B 在 PANC-1 細(xì)胞中，Ad(CON)中增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）在 1MOI 轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況。EGFP 表達(dá)用于評(píng)估 PANC-1 細(xì)胞中 Ad (FOXL1)、Ad (PP2A) or Ad (FOXL1 +PP2A)病毒轉(zhuǎn)后蛋白表達(dá)的效率。倒置熒光顯微鏡觀察顯示 Ad (CON) 病毒轉(zhuǎn)染后 85% PANC-1 細(xì)胞 EGFP達(dá)增高，綠色明顯，，該腺病毒轉(zhuǎn)染效率符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。Ad (CON) ( EGFP 過表達(dá))，Ad (FOXL1)FOXL1 過表達(dá)組)，Ad (PP2A) ( PP2A 過表達(dá)組)和 Ad (FOXL1+PP2A) (FOXL1 和 PP2A 聯(lián)合表達(dá)組)可以有效轉(zhuǎn)染入胰腺導(dǎo)管上皮腫瘤細(xì)胞 PANC-1 中。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9

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