發(fā)布時間：2020-05-08 16:11

【摘要】：研究背景:泌尿系統(tǒng)腫瘤中最常見的就是膀胱癌,主要是指膀胱黏膜細胞發(fā)生癌變,其中尿路上皮發(fā)生癌變(即臨床常說的移行細胞癌)最為常見。膀胱癌的發(fā)病率在世界范圍內不斷升高,在我國其已經(jīng)成為泌尿系統(tǒng)內發(fā)病率最高的惡性腫瘤,并且其病死率呈每年逐步升高趨勢。流行病學調查研究發(fā)現(xiàn)男性膀胱癌的發(fā)病率高出女性2-3倍之多,在中國惡性腫瘤發(fā)病率排行中,男性群體中膀胱癌發(fā)病率位于第8位,而女性排行則為第12位。臨床研究發(fā)現(xiàn),按照膀胱癌浸潤程度劃分,淺表性膀胱癌在臨床極為常見。淺表性膀胱癌臨床又將其稱為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC),而非肌層浸潤性膀胱癌現(xiàn)有的一線臨床治療方法中,經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)是最常用的治療方法之一,而早期手術被認為是膀胱癌預后效果的關鍵影響因素。早期手術雖然能夠術切除大部分癌細胞,但是術后復發(fā)率、復發(fā)患者惡性程度上升等均已經(jīng)稱為膀胱癌致死的重要因素,因此早期手術后進行輔助抗癌就顯得極為重要。膀胱內藥物灌注免疫治療在淺表性膀胱癌的治療中已經(jīng)被廣泛認可,早期手術后輔以膀胱灌注化療被認為不僅能夠有效降低患者術后復發(fā)的風險,而且能夠有效提升預后效果和生存率,但是目前仍有超過60%的癌癥患者術后復發(fā)�？ń槊�(Bacillus Calmette Guérin,BCG)膀胱灌注作為目前臨床治療淺表性膀胱癌一線免疫治療方案,是膀胱癌輔助抗癌金標準療法之一,被認為是灌注化療失敗后最有效的方法,但仍有30-45%病人對BCG治療無反應,20%患者不能耐受其毒副作用。而且仍有一定比例病人不能耐受其毒副作用如出血性膀胱炎、造血和免疫功能抑制等,嚴重降低患者日常生活的質量。因此,改善BCG抗癌療效、降低毒副作用是目前膀胱癌灌注治療研究的熱點。BCG聯(lián)合化療藥物是目前可應用于臨床的方法,效果與BCG單獨應用的效果更具優(yōu)勢,而且有利于降低BCG有效治療所需劑量。三氧化二砷(縮寫為As2O3,即ATO)作為我國中醫(yī)藥體系中傳統(tǒng)治療藥物——砒霜最重要的藥物成分,能夠有效治療包括梅毒、結核、癌癥等多種疾病,臨床上歷史悠久,上個世紀90年代我國科研工作者發(fā)現(xiàn)其能夠靶向性治療急性早幼粒細胞白血病(APL)并取得了突出的療效,自此三氧化二砷的抗腫瘤活性引起了世界性的關注。在1999年,中國國家食品藥品監(jiān)督管理局(即SFDA)就已經(jīng)審核通過了ATO注射液的生產(chǎn)申請,并允許其在臨床治療中應用,而美國食品與藥物管理局相繼在2000年通過了關于ATO注射液在美國上市的申請,將其批準成為復發(fā)/難治性APL治療的二線藥物。三氧化二砷對血液系統(tǒng)疾病療效顯著,通過觀察分析ATO應用到血液系統(tǒng)腫瘤患者之后的效果發(fā)現(xiàn),使用ATO之后血液系統(tǒng)腫瘤治療效果(完全緩解率)、遠期生存率等顯著提高,且復發(fā)率明顯下降、不良反應明顯減輕,并且其并會與所用的其他化療藥物發(fā)生交叉耐藥的現(xiàn)象。近年來,在實體腫瘤的臨床治療中,ATO的應用范圍不斷拓展,肺癌,乳腺癌,胃癌,前列腺癌,結腸癌,卵巢癌;肝癌等諸多實體腫瘤中均有其研究報道所查。目前諸多體內外相關實驗表明ATO作為腫瘤治療藥物,對腫瘤細胞凋亡具有選擇性誘導作用,而且能夠不影響正常細胞的凋亡過程及抗腫瘤血管生成作用。但ATO的抗腫瘤作用具有明顯的劑量和時間依賴特性,ATO治療窗比較窄,大劑量ATO對正常細胞有明顯的毒性作用,因此有效的給藥途徑和用藥劑量是決定ATO臨床療效的關鍵。選擇較低且有效的藥物濃度,在保證抗腫瘤療效的同時減少副作用是臨床用藥的基本原則。連接蛋白(Connexin,Cxs)有趨同的基本架構,具體結構的組成成分同時含有疏水跨膜片段(共4個)和親水段,其中親水段的位置在胞內環(huán)(1個)與胞外環(huán)(2個,組成成分均是6個保守性半胱氨酸殘基)之間,而蛋白羧基末端、氨基末端全部存在于胞質之內。Cxs具有多種不同形式的羧基末端,是公認的關鍵部位,并在蛋白間相互作用過程中發(fā)揮著極其重要的調節(jié)作用。細胞縫隙連接(Gap junction,GJs)是由兩個細胞縫隙連接蛋白六聚體互相對接形成的跨膜通道結構,在細胞表面還存在著許多未配對的半通道,與細胞縫隙連接有著相似的通透特性。細胞縫隙連接蛋白的半通道允許細胞交換分子量為1000D以下的離子、代謝產(chǎn)物、離子(K~+、Ca~(2+))、白介素(IL-6、IL-10)和其他第二信使(cAMP、GSH、cGMP、NO和IP_3等),大分子則不允許通過(小RNAs除外),在溝通細胞間及細胞與基質間信息,調控細胞代謝,增殖分化中發(fā)揮重要作用,已經(jīng)有超過20種細胞縫隙連接蛋白被鑒定,幾乎所有其它類型的細胞都有GJs的存在,除外骨骼肌、成熟的紅細胞及精子,組織表達分布最廣與腫瘤的關系最密切的是Cx43,在多種惡性腫瘤細胞中Cx43的表達下調與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移有關。在膀胱癌組織中的研究證實,腫瘤病灶周圍的正常膀胱組織,其細胞內的Cx43蛋白多表現(xiàn)出高水平表達狀態(tài),在膀胱尿路上皮癌細胞中低表達。Cx43的基因突變極少見,其表達及功能的調控主要在轉錄及轉錄后水平進行。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ATO可能通過調節(jié)CX43表達產(chǎn)生生物學效應,但是由于目前相關機制以及ATO聯(lián)合BCG抗腫瘤效應、機制的研究仍屬于空白。研發(fā)新型膀胱癌治療藥物不僅需要進行體外實驗研究,而且需要進行體內實驗模型建立并進一步證實其對機體的有效性和安全性�，F(xiàn)今醫(yī)療研究中,膀胱癌的體外模型建立方法中最常用的就是向體內輸注人膀胱癌細胞,該方法建立的實驗模型不僅能夠用于膀胱癌發(fā)生機制的各項研究中,而且能夠初步評價抗膀胱癌治療藥物在體內應用的效果和安全性。體外動物模型建立的優(yōu)勢在于實驗條件具有可控制性、操作方便、實驗耗時較短,而且研發(fā)費用極為低廉;但是其缺點也極為明確,目前所用的膀胱癌細胞系其腫瘤細胞種類單一,并且均在體外生長,在生長方式、生長微環(huán)境、細胞構成種類方面不能夠與人體膀胱癌細胞完全一致,因此其無法完全模擬人體膀胱癌組織發(fā)生病變特點,無法代表化療藥物毒副反應,由此可見,單純體外研究成果并不能夠完全反應化療藥物在體內作用的有效性、安全性,建立體內實驗模型評價化療藥物治療惡性腫瘤可行性是極為必要的。雖然目前惡性腫瘤動物模型建立過程可供選擇的動物種類較多,但是最常用的動物種類仍然是小鼠或者裸小鼠,主要原因在于鼠類體型較小、繁殖時間短、遺傳基因與人類有清晰的同源性、且生理生化代謝過程特點與人類高度相似,因此,相較于其他種類動物模型,裸小鼠惡性腫瘤模型能更好論證化療藥物可行性、有效性和安全性,并能夠初步反應出藥物體內代謝過程和動力學特點,因此,在膀胱癌新藥研發(fā)中進行動物在體實驗是必須的。鑒于此,本研究將利用人膀胱癌細胞系BIU-87、T24、5637等膀胱癌細胞株先設計特定的與臨床極其相關的體外實驗體系,隨后建立膀胱癌異位移植瘤裸小鼠動物模型,通過體外細胞層次研究、實驗動物在體實驗研究兩個層次綜合分析三氧化二砷成為膀胱癌灌注化療藥物的可行性,通過體內、體外充分論證其藥物治療的有效性、安全性,為臨床應用三氧化二砷治療膀胱癌奠定實驗基礎,為臨床推廣中醫(yī)藥抗腫瘤治療奠定科學而堅實的理論基礎。本實驗的主要目的是:(1)體外培養(yǎng)人膀胱癌細胞系BIU-87、T24、5637等膀胱癌細胞特定的體外細胞培養(yǎng)實驗,通過多種實驗技術及手段,確立膀胱癌模型建立方法(2)體外培養(yǎng)人膀胱癌細胞系,通過給予不同濃度的ATO,模擬ATO不同給藥劑量對于腫瘤細胞增殖的影響,同時通過從細胞和分子層面針對三氧化二砷影響縫隙連接蛋白43與抗腫瘤作用的關系進行探討。(3)膀胱癌皮下移植瘤小鼠模型建立過程中,選取的膀胱癌細胞種類為5637,細胞注射方式為皮下注射,通過腹腔注射不同藥物的方法,分析干預方法對于腫瘤細胞的影響,初步分析ATO聯(lián)合BCG膀胱灌注治療膀胱癌移植瘤的效果和可能的抗腫瘤效應作用機制。方法:將NBT-II膀胱癌細胞株、BIU-87型膀胱癌細胞株、5637型膀胱癌細胞株、T24膀胱癌細胞株以及PBS細胞株進行體外傳代培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,細胞體外培養(yǎng)進入對數(shù)生長階段之后,利用專用細胞平體外培養(yǎng)基對目標細胞進行重懸,調整細胞濃度,分別注射到Balb/c雌裸小鼠體內,根據(jù)所注射細胞的不同,將小鼠分為5組,分組結果為5637組、NBT-II組、BIU-87組、T24組以及PBS組,觀察分析小鼠皮下腫瘤形成和生長情況,確定膀胱癌建模細胞種類,為體內實驗建模奠定基礎。1、利用5637膀胱癌細胞株建立模擬臨床膀胱癌術后膀胱灌注化療藥物的體外實驗體系,根據(jù)干預方法的不同分為6組,依次為正常培養(yǎng)組(實驗過程中未添加任何對細胞有影響的干預措施)、5μmol/L組(As2O3應用劑量為5μmol/L)、10μmol/L組(As2O3應用劑量為10μmol/L);、15μmol/L組(As2O3應用劑量為15μmol/L)、20μmol/L組(As2O3應用劑量為20μmol/L)、25μmol/組(As2O3應用劑量為25μmol/L),在完成細胞體外藥物干預之后,在干預的24h、48h分別完成細胞增殖情檢測況,同時對不同干預方法的各組的蛋白表達水平予以測定,其中蛋白檢測指標包括Cx43、Nrf2、JNK、JNK-1,檢測方法是western blot,基因檢測指標是Cx43,檢測方法是PCR法,采用CCK-8檢測膀胱癌細胞存活率、應用流式細胞技術觀察ATO對細胞凋亡情況的影響,從分子水平、基因水平對三氧化二砷對縫隙連接蛋白43及半通道的作用與抗膀胱癌作用的內在分子機制進行檢測和分析,檢測Cx43表達改變。2、選取5637作為膀胱癌動物模型建立的細胞株經(jīng)皮下注射癌細胞并成功建立移植瘤模型之后,當平均腫瘤體積達100mm~3~150mm~3大小時,依據(jù)瘤體積、裸鼠體重,遵循均衡隨機原則,將模型鼠平均分為為4組,每組中實驗動物模型均為9只,各組小鼠的腫瘤體積等差異均未超過均值的10%,并且按以下方案^u始給藥:(1)三氧化二砷組:給予As2O3 10mg/kg;(2)Gap26組,Gap26阻滯后給予As2O310mg/kg;(3)空白對照組,不添加藥物及阻滯劑,僅給予0.9%NaCl;(4)聯(lián)合組,As2O3 10mg/kg+卡介苗(BCG)100g,連續(xù)干預10天,觀察記錄干預前后各組分別處理小鼠,觀察對比瘤積和瘤重變化,同時各組移植瘤小鼠Cx43表達水平進行測定,從分子水平對As_2O_3與BCG對縫隙連接蛋白43的作用與抗膀胱癌作用的內在分子機制進行檢測和分析。3、統(tǒng)計學處理:采用統(tǒng)計學專業(yè)軟件(SPSS 13.0)對實驗數(shù)據(jù)進行分類、整理和統(tǒng)計學分析,其中在分析不同阻滯劑在不同處理時間下對Cx43,p-Cx43總蛋白的影響需要行析因分析。對時間、阻滯劑單獨效應等資料進行分析時則需用單因素方差分析,如果數(shù)據(jù)的方差不齊時,則需要以welch校正法對數(shù)據(jù)進行校正,方差不齊數(shù)據(jù)的分析方法為DunnettT3法。滿足方差齊性條件的數(shù)據(jù)在分析時,按照均數(shù)士標準差(x±s)形式將數(shù)據(jù)表示后,多組間兩兩比較的方法是LSD法,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),等級資料均以非參數(shù)檢驗(Independent Samples Test)完成,顯著性評價水準是a=0.05,P0.05認為有顯著性。結果:1、BIU-87組、5637組、NBT-II組和T24組在實驗過程中各組裸鼠狀態(tài)好,體重無明顯下降,無提前死亡小鼠出現(xiàn),實驗中全部所用小鼠在實驗過程中并無嚴重不良反應顯現(xiàn),均飲食排便正常。在注射相同濃度細胞懸液的情況下,按腫瘤體積大于0.1cm~3為成瘤標準,NBT-II組出瘤率最高,其次為5637組,各組裸鼠的膀胱癌出瘤率存在明顯差異(P0.05);裸鼠皮下移植性膀胱癌模型裸鼠體重隨著時間變化而體重明顯改變(P0.05),NBT-II組和5637組在腫瘤體積、腫瘤重量以及增長速度方面并無明顯差異(P0.05)。2、CCK-8方法顯示As2O3處理膀胱癌細胞在濃度10umol/LAs2O3即可產(chǎn)生明顯抑制增殖效果,且As2O3抑制效果呈明顯濃度依賴效應關系,LD50約為20umol/L;Western Blot對蛋白定量分析顯示:和對照組定量分析結果比較,處理12h后,As2O3對Cx43、Nrf2、JNK及JNK-1蛋白表達都有明顯的上調,隨著藥物劑量增加而增加,不同As2O3處理間具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。3、在給藥之前,各組裸鼠瘤積未見無顯著性差異(P0.05),應用藥物干預之后,As2O3組、聯(lián)合組裸鼠的瘤積、瘤重均出現(xiàn)大幅下降,與本組給藥治療前比較,數(shù)據(jù)有顯著性變化(P0.05);而且在經(jīng)過藥物治療后,聯(lián)合組瘤積、瘤重相較于其他各組,均處于顯著低水平(P0.05),且As2O3組的瘤積和瘤重顯著低于Gap26組和對照組,組間相比有統(tǒng)計學差異(P0.05);聯(lián)合組、As2O3組瘤在體內均有大量壞死組織出現(xiàn),且殘存活性細胞的核分裂現(xiàn)象減少,部分區(qū)域可見腫瘤細胞無一不出現(xiàn)壞死、消失,而且在細胞內部,棕黃色顆粒多見且大量沉著,細胞染色結果大部分是陽性;Gap 26組腫瘤細胞壞死不明顯,大部分腫瘤細胞生長旺盛,黃色顆粒沉著很少,細胞染色多為弱陽性,空白對照組的癌細胞表現(xiàn)促快速生長趨勢,核分裂多見,黃色顆粒沉著極為稀少,組間CX43水平差異顯著(P0.05)。結論:人膀胱癌T-24、BIU-87、5637細胞在成瘤率方面具有明顯差異,在建立膀胱癌模型過程中應選用成瘤較高、穩(wěn)定性較好、且為人源性的5637細胞進行模型建立。體外實驗體系中,低濃度的三氧化二砷即可以有效抑制生長,并使縫隙鏈接蛋白43表達上調,而且三氧化二砷抑制效果具有明顯的時間和劑量依賴性,使用半通道特異性阻滯劑后三氧化二砷抗腫瘤效用明顯減低,提示三氧化二砷抗腫瘤作用與半通道開放有關。三氧化二砷與BCG合用能夠明顯上調縫隙鏈接蛋白表達,抑制裸小鼠皮下膀胱癌細胞移植瘤的生長,其效果明顯優(yōu)于三氧化二砷單獨使用。綜上所述,本課題立足于臨床治療效果,從體外實驗、在體實驗兩種不同實驗體系分別揭示了中藥砒霜主要成分——三氧化二砷的抗腫瘤效果,初步明確了其成為膀胱癌術后新型輔助治療藥物的可行性、有效性、安全性,在醫(yī)學研究領域初步明確了三氧化二砷具有重要抗腫瘤治療應用價值。
【圖文】：

MAPK信號通路Figure1MAPKsignalpathway

2 結果2.1 各組小鼠成活情況實驗過程中各組裸鼠狀態(tài)好，體重無明顯下降，無明顯并發(fā)癥，無提前死亡小鼠出現(xiàn)，且實驗中全部入選小鼠并沒有嚴重不良反應出現(xiàn)，進水、飲食、二便均無異常。2.2 在相同條件不同膀胱癌細胞出瘤率比較在每組注射相同濃度細胞懸液的情況下，按腫瘤體積大于 0.1cm3為成瘤標準，NBT-II 組出瘤率最高，在其腹部可見明顯腫瘤突出形成（圖 2），其次為 5637 組（圖3），而其他三組幾乎未見成功出瘤，，各組裸鼠的膀胱癌出瘤率存在明顯差異（P<0.05）。見表 1。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

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本文編號：2654892