發(fā)布時(shí)間：2020-05-06 20:49

【摘要】：研究目的:乳腺癌是全世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。近年來(lái)在中國(guó),乳腺癌的發(fā)病率以每年3%的增長(zhǎng)速度增加[2,3]。截止到2014年,中國(guó)新發(fā)乳腺癌患者占全球新發(fā)乳腺癌患者的12.2%,乳腺癌病死數(shù)達(dá)到了全球總數(shù)的9.6%[3,4]�；瘜W(xué)療法,簡(jiǎn)稱化療,作為極為重要的乳腺癌臨床治療方式,能夠顯著延長(zhǎng)乳腺癌患者的無(wú)病生存期及總生存期,提高患者術(shù)后生活質(zhì)量,在臨床中應(yīng)用極為廣泛,造福了廣大乳腺癌患者。然而,由于乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物(如阿霉素)產(chǎn)生耐藥性常常導(dǎo)致化療失敗,威脅乳腺癌患者的生存。因此,研發(fā)出能夠抑制化療耐藥的輔助性治療藥物成為解決目前這一窘境的重要方式。為減少多重耐藥的產(chǎn)生,基礎(chǔ)研究以及臨床工作中通常采用不同藥物配伍使用的方式。近年來(lái),聯(lián)合應(yīng)用中藥治療乳腺癌越來(lái)越受到矚目[5]。許多研究表明,化療聯(lián)合中藥可降低化療引起的副反應(yīng),從而改善乳腺癌患者預(yù)后并提高生活質(zhì)量�；倍鳛閭鹘y(tǒng)中藥已有1,600年之久,近幾十年來(lái),因其有效的抗癌作用已被常規(guī)用作乳腺癌的輔助治療藥物。但其對(duì)乳腺癌化療耐藥的作用尚不明確。本研究通過(guò)分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究,探討槐耳對(duì)乳腺癌阿霉素耐藥的影響及其作用機(jī)制,為乳腺癌患者臨床用藥提供重要的理論依據(jù)。研究方法及結(jié)果:在本課題中,我們對(duì)槐耳抑制乳腺癌阿霉素耐藥的機(jī)制進(jìn)行了全面深入的研究,具體研究?jī)?nèi)容主要包括以下四部分:第一部分乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株的建立及槐耳抑制阿霉素耐藥研究方法:經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)8個(gè)月時(shí)間的研究及培育,我們團(tuán)隊(duì)在體外應(yīng)用阿霉素(0.01uM~0.1mM)逐步加壓誘導(dǎo)篩選MDA-MB-231細(xì)胞,最終培養(yǎng)出耐阿霉素的耐藥細(xì)胞株(231/Dox)。乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞的耐藥表型利用含50ng/ml阿霉素的DMEM培養(yǎng)基加壓培養(yǎng)加以維持。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞系(231/Dox)及親代MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系對(duì)阿霉素的敏感性,以驗(yàn)證阿霉素耐藥細(xì)胞系是否成功建立及槐耳對(duì)乳腺癌阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞耐藥性的影響。研究結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,乳腺癌阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞相較于親代MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞,其對(duì)阿霉素殺傷作用的敏感性降低,表現(xiàn)為耐藥細(xì)胞的IC50數(shù)值的增加,是非耐藥細(xì)胞IC50值的3.27倍。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果提示槐耳可抑制乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞系231/Dox的生長(zhǎng),并可顯著增加阿霉素耐藥細(xì)胞系對(duì)阿霉素的敏感性。第二部分槐耳可促進(jìn)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞的凋亡研究方法:為深入研究槐耳抑制阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞耐藥性的分子生物學(xué)機(jī)制,我們利用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)及TUNEL實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)槐耳對(duì)阿霉素耐藥細(xì)胞系231/Dox細(xì)胞凋亡的影響;并通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)槐耳對(duì)凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平及活化狀態(tài)的影響。研究結(jié)果:流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)及TUNNEL檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示槐耳可增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的阿霉素耐藥細(xì)胞的凋亡;蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示槐耳處理可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果表明槐耳可促進(jìn)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞的凋亡,從而抑制乳腺癌阿霉素耐藥。第三部分槐耳可抑制阿霉素耐藥細(xì)胞的藥物外排功能研究方法:我們利用鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein-AM)標(biāo)記耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞,檢測(cè)槐耳是否對(duì)阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞(231/Dox)藥物外排功能產(chǎn)生的影響,并利用熒光檢測(cè)儀測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。同時(shí)利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)P-gP蛋白在阿霉素耐藥細(xì)胞(231/Dox)及親代MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平差異,并觀察槐耳是否能夠影響P-gP蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果:熒光定量檢測(cè)結(jié)果顯示,槐耳短時(shí)間(30分鐘)處理乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞并不能增加細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度;但耐藥細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間(24小時(shí))的槐耳處理后,細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度可顯著增加。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與親代MDA-MB-231細(xì)胞相比,P-gP蛋白在阿霉素耐藥細(xì)胞系乳腺癌阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞231/Dox中表達(dá)量顯著升高;耐藥細(xì)胞經(jīng)過(guò)槐耳處理后,P-gP蛋白的表達(dá)水平隨著槐耳濃度的增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降。第四部分槐耳靶向AKT信號(hào)通路抑制乳腺癌阿霉素耐藥研究方法:通過(guò)AKT過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKT及AKT信號(hào)通路在阿霉素耐藥、細(xì)胞凋亡及P-gP表達(dá)中的作用;并通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槐耳是否能夠影響AKT及AKT信號(hào)通路。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀察槐耳是否靶向作用于AKT及AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)阿霉素耐藥細(xì)胞的凋亡并抑制P-gP蛋白表達(dá)量,從而抑制乳腺癌阿霉素耐藥。研究結(jié)果:過(guò)表達(dá)AKT可降低乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性,而槐耳則可逆轉(zhuǎn)AKT過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的阿霉素耐藥性的增加;進(jìn)一步的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AKT的過(guò)表達(dá)可調(diào)節(jié)凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡;并且過(guò)表達(dá)AKT還可上調(diào)P-gP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平,從而增強(qiáng)細(xì)胞的藥物外排功能;與此同時(shí),槐耳則可通過(guò)抑制AKT的表達(dá)水平,相應(yīng)地活化凋亡通路,并下調(diào)P-gP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量。結(jié)論:1.槐耳抑制乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞的耐藥性。2.槐耳促進(jìn)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞的凋亡;3.槐耳下調(diào)耐藥細(xì)胞P-gP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)并抑制乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞的藥物外排功能;4.槐耳通過(guò)靶向作用于AKT信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥。意義:1、闡明了槐耳對(duì)乳腺癌阿霉素耐藥的抑制作用及其作用機(jī)制;2、證實(shí)了槐耳是乳腺癌化學(xué)療法的有效增敏劑,并能一定程度上抑制阿霉素耐藥,為乳腺癌臨床輔助治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊愛(ài)琳;胡仲冬;屠鵬飛;;槐耳抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J];中國(guó)中藥雜志;2015年24期

2 Ching-Ying Huang;Linda Chia-Hui Yu;;Pathophysiological mechanisms of death resistance in colorectal carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2015年41期

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本文編號(hào)：2651838