【摘要】：第一部分乏氧微環(huán)境對乳腺癌腫瘤再生細胞增殖的影響目的:腫瘤干細胞(CSCs)是一群具自我更新,多能分化及啟動體內(nèi)腫瘤生長潛能等干細胞特性的腫瘤細胞,也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療抵抗和治療后復發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動因素。乏氧是調(diào)節(jié)腫瘤干細胞自我更新的關(guān)鍵微環(huán)境因子,同時也可以使腫瘤干細胞富集,但是氧是否可以直接促進腫瘤干細胞的增殖并不清楚。本部分研究基于三維軟纖維蛋白基質(zhì)膠(3D fibrin)分離篩選出乳腺癌腫瘤干細胞(定義為腫瘤再生細胞,TRCs),利用血管內(nèi)皮生長因子抑制劑構(gòu)建腫瘤乏氧模型,探討體內(nèi)外乏氧對腫瘤干細胞增殖的影響。方法:(1)使用蘋果酸舒尼替尼構(gòu)建腫瘤乏氧模型;觀察兩組腫瘤體積的大小,免疫熒光染色檢測腫瘤組織內(nèi)的乏氧區(qū)域及血管分布情況;(2)使用流式細胞儀從乳腺癌腫瘤組織中分選出ALDH高表達及低表達的腫瘤細胞,并將其接種至三維軟纖維蛋白基質(zhì)膠中,觀察比較ALDH~+和ALDH~-細胞形成的克隆數(shù)目。(3)Real time PCR檢測兩組腫瘤組織中干性基因的表達(ALDH1A1、OCT4、KLF4、SOX2),Western blot檢測ALDH1A1、PCK2的蛋白表達水平。(4)利用BrdU免疫熒光染色觀察兩組腫瘤組織中腫瘤干細胞的增殖情況。(5)將MCF-7、BT474及人原代乳腺癌TRCs分別置于常氧(21%O_2)和乏氧(1%O_2)的條件下培養(yǎng)6天,統(tǒng)計克隆體積及克隆數(shù)量;(6)利用CoCl_2模擬乏氧,觀察不同濃度CoCl_2對MCF-7 TRCs克隆體積及數(shù)量的影響;(7)利用BrdU染色,觀察兩組細胞的增殖,同時利用PI和AnnexinV雙染檢測其凋亡;(8)采用Real time PCR檢測干性基因在兩組細胞中的表達差異。(9)將不同數(shù)量的常氧與乏氧MCF-7 TRCs接種于NOD-SCID小鼠乳腺墊下,觀察兩組的成瘤率及成瘤時間的差異。結(jié)果:(1)舒尼替尼處理組腫瘤體積明顯縮小、乏氧區(qū)域明顯增多,CD31染色顯示血管分布減少。(2)ALDH~+腫瘤細胞形成的克隆數(shù)目顯著高于ALDH~-的腫瘤細胞;(3)舒尼替尼處理組干性基因表達水平明顯升高,ALDH蛋白表達上調(diào),PCK2蛋白表達下調(diào)。(4)舒尼替尼處理組乏氧區(qū)域內(nèi)ALDH及BrdU表達升高。(5)在乏氧情況下,MCF-7、BT474及人原代乳腺TRCs克隆體積明顯增大。(6)在一定的濃度范圍內(nèi),隨著CoCl_2濃度的增加,MCF-7 TRCs克隆體積逐漸增大。(7)與常氧對照相比,乏氧組MCF-7 TRCs顯著增加DNA合成(S期)。(8)乏氧組腫瘤干性基因(CD133、OCT4、KLF4、ALDH、SOX2)的表達明顯高于常氧組。(9)乏氧組的成瘤能力顯著高于常氧組。結(jié)論:乏氧微環(huán)境可以明顯促進乳腺癌腫瘤再生細胞的增殖,誘導其腫瘤干細胞表型的表達,同時明顯增強乳腺癌腫瘤再生細胞在體內(nèi)的致瘤性。第二部分乏氧微環(huán)境介導的TCA循環(huán)重塑與ROS生成的機制研究目的:通過分析TCA循環(huán)中間代謝產(chǎn)物的變化,探索乏氧介導ROS升高的機制;進一步探究ROS促進乳腺癌腫瘤再生細胞增殖的機制。方法:(1)在常氧和乏氧情況下,使用ROS熒光探針檢測MCF-7以及人原代乳腺癌腫瘤再生細胞(TRCs)中的ROS水平,檢測乏氧情況下經(jīng)ROS清除劑NAC處理后MCF-7 TRCs細胞內(nèi)ROS水平;(2)乏氧情況下,經(jīng)不同濃度NAC和有氧情況下不同濃度H2O2處理后,觀察MCF-7 TRCs的克隆體積;(3)乏氧情況下,使用ROS熒光探針檢測MCF-7及MCF-7 TRCs細胞內(nèi)ROS水平,同時在2D培養(yǎng)的MCF-7細胞中,加入不同濃度NAC,計數(shù)檢測MCF-7細胞的增殖狀況;(4)Western blot檢測MCF-7及人原代乳腺癌TRCs中NF-κB和Akt的表達及NAC處理后NF-κB和Akt磷酸化水平的變化;(5)MCF-7 TRCs經(jīng)NF-κB和Akt抑制劑處理后,Western blot檢測NF-κB和Akt磷酸化水平,并觀察MCF-7 TRCs的克隆體積的變化;(6)13C標記的葡萄糖處理MCF-7 TRCs后LC/MS/MS檢測TCA循環(huán)的代謝變化;(7)Western blot檢測TCA循環(huán)限速酶CS、IDH3G、OGDH的表達;(8)使用si RNA沉默MDH2、IDH3G后,觀察MCF-7 TRCs克隆體積變化,同時,使用ROS熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平;(9)使用si RNA沉默IDH3G,同時加入不同濃度的H2O2,觀察MCF-7 TRCs克隆體積變化;(10)LC/MS/MS檢測TCA循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及蘋果酸的含量;(11)使用不同濃度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富馬酸二甲酯(DMF)和L-蘋果酸處理常氧MCF-7 TRCs后,ROS熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平;(12)常氧乏氧情況下,使用LC/MS/MS檢測MCF-7 TRCs細胞內(nèi)GSF含量;(13)在常氧與乏氧情況下,使用NADPH及GSH試劑盒檢測MCF-7 TRCs胞內(nèi)NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比值;(14)GSH-MEE處理乏氧的MCF-7 TRCs后,使用NADPH及ROS熒光探針檢測細胞內(nèi)NADPH/NADP+及ROS水平;(15)加入不同濃度GSH-MEE處理MCF-7 TRCs后,觀察克隆體積變化;(16)使用si RNA沉默IDH3G后,檢測GSF的含量變化及細胞內(nèi)NADPH/DNAP+的比值。結(jié)果:(1)乏氧情況下,MCF-7、人原代乳腺癌TRCs中ROS含量升高,經(jīng)NAC處理后ROS含量下降,且呈濃度梯度依賴;(2)乏氧情況下加入NAC清除ROS后,有效阻礙了TRCs的生長;反之,常氧條件下加入低濃度的H2O2可促進MCF-7 TRCs的生長;(3)常規(guī)2D培養(yǎng)的MCF-7細胞在乏氧條件下具有更高的ROS水平,NAC處理降低ROS水平后,乏氧所致的生長遲緩得到明顯恢復。(4)乏氧導致MCF-7 TRCs中NF-κB和Akt磷酸化水平升高,加入NAC后磷酸化水平受抑制;(5)使用NF-κB和Akt抑制劑后,MCF-7 TRCs NF-κB和Akt磷酸化減弱,增殖明顯被抑制;(6)13C葡萄糖同位素示蹤試驗顯示乏氧時MCF-7 TRCs的TCA循環(huán)明顯減慢;(7)乏氧時,MCF-7 TRCs中TCA循環(huán)的限速酶CS、IDH3G、OGDH的表達均下調(diào);(8)沉默MDH2后MCF-7 TRCs細胞內(nèi)ROS水平升高且克隆體積增大;而沉默IDH3G后細胞內(nèi)ROS水平降低,克隆體積明顯縮小;(9)H2O2可以逆轉(zhuǎn)沉默IDH3G后克隆體積的縮小;(10)乏氧時,TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及蘋果酸均升高,且延胡索酸及蘋果酸升高尤為明顯;(11)不同濃度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富馬酸二甲酯(DMF)和L-蘋果酸處理常氧MCF-7 TRCs后,僅DMF使細胞內(nèi)ROS水平升高且與濃度呈正比;(12)與常氧相比,乏氧MCF-7 TRCs細胞內(nèi)GSF比例升高且胞內(nèi)NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比例均降低。(13)GSH-MEE處理乏氧MCF-7 TRCs后,細胞內(nèi)NADPH/DNAP+升高,ROS水平降低,阻礙了乏氧對于TRC生長的促進作用;(14)琥珀�；入赘孰牡纳咭约癗ADPH/NADP+的降低可通過IDH3G補救。結(jié)論:乏氧導致TCA循環(huán)流動減慢,致使中間代謝產(chǎn)物延胡索酸堆積,而延胡索酸積累則導致琥珀�；入赘孰牡男纬�,在GSF的形成過程中消耗了GSH及NADPH最終導致MCF-7 TRCs內(nèi)的ROS水平增加。同時,ROS水平升高激活信號分子NF-κB和Akt,促進人乳腺癌TRC的生長。第三部分HIF-1α介導的PCK2下調(diào)在乳腺癌TRCs TCA循環(huán)重塑中的作用目的:以乳腺癌MCF-7細胞為模型,探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK2)的下調(diào)表達對腫瘤再生細胞(TRCs)TCA循環(huán)中間代謝物(草酰乙酸、延胡索酸)的影響以及導致乏氧乳腺癌TRC中的延胡索酸積累的原因。同時進一步探究乏氧情況下PCK2下調(diào)表達的分子機制.方法:(1)乏氧情況下,Western blot檢測MCF-7 TRCs中PCK2的表達情況;(2)使用四環(huán)素誘導的PCK2過表達系統(tǒng),檢測PCK2高表達后乳腺癌TRCs中延胡索酸,琥珀�；入赘孰�(GSF)和ROS水平以及NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值;(3)利用OAA檢測試劑盒檢測有氧、乏氧情況下及PCK2高表達后OAA含量的變化;(4)利用同位素標記的13C葡萄糖處理MCF-7 TRCs后,使用LC/MS/MS檢測PCK2過表達后TCA循環(huán)的流動情況;(5)Western blot檢測MCF-7 TRCs中HIF的表達,同時沉默或過表達HIF-1α后檢測PCK2蛋白的表達水平;(6)利用同位素標記的13C檢測HIF-1α沉默后TCA循環(huán)的流動情況;(7)UCSC基因組瀏覽器和JASPAR分析PCK2的啟動子區(qū)域是否存在HIF-1α結(jié)合位點,并用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進一步驗證;(8)利用PCK2啟動子螢光素酶測定熒光素酶的表達,以確定HIF-1α與PCK2之間的調(diào)控關(guān)系;(9)使用富馬酸二甲酯(DMF)處理缺氧的MCF-7 TRCs,Western blot檢測HIF-1α及PCK2的表達;結(jié)果:(1)乏氧時,MCF-7 TRCs的PCK2表達下調(diào);(2)過表達PCK2后,延胡索酸、GSF和ROS水平降低,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值增加;(3)乏氧時,MCF-7 TRCs細胞內(nèi)OAA含量升高,PCK2過表達后OAA含量下降;(4)乏氧時,PCK2過表達后,TRCs的TCA循環(huán)加速,m+2和m+4形式的檸檬酸,α-酮戊二酸,延胡索酸和蘋果酸比例升高;(5)常氧和乏氧乳腺癌TRCs均表達HIF-2α,而HIF-1α僅在乏氧的TRCs中顯著上調(diào)。si RNAs沉默HIF-1α時,PCK2表達上調(diào),過表達HIF-1α后,PCK2表達下調(diào);(6)HIF-1α沉默后促進TCA循環(huán)的流動;(7)UCSC基因組瀏覽器和JASPAR分析揭示在PCK2的啟動子區(qū)域存在多個HIF-1α的結(jié)合位點,并且Chip-PCR測定表明HIF-1α可以直接結(jié)合到PCK2的啟動子區(qū);(8)PCK2啟動子螢光素酶測定顯示,HIF-1α敲低增加螢光素酶的活性,HIF-1α過表達降低螢光素酶活性;(9)富馬酸二甲酯(DMF)處理乏氧乳腺癌TRCs后,HIF-1α的表達增強,且PCK2表達降低。結(jié)論:PCK2下調(diào)導致的OAA積累阻礙了TCA循環(huán)的碳流動并導致乏氧乳腺癌TRCs中的延胡索酸積累;缺氧誘導的HIF-1α負調(diào)節(jié)PCK2表達,延胡索酸積累進一步加強了這種反饋。
【圖文】：

尼治療構(gòu)建 MCF-7 瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境替尼是一種 VEGF 受體酪氨酸激酶抑制劑，在臨床中用作抗血腫瘤內(nèi)缺氧[47]。為了在體內(nèi)探究乏氧是否可以促進腫瘤干細胞MCF-7 TRCs 注射到裸鼠皮下，并且當腫瘤長到 50-100mm3時60mg/kg/天）治療小鼠。35 天后，將小鼠處死，應用乏氧probe）及 CD31 熒光染色評價腫瘤組織內(nèi)乏氧及血管分布情況替尼處理后，小鼠腫瘤生長變緩，腫瘤體積較對照組明顯縮探針 Hypoxyprobe 染色顯示舒尼替尼治療組小鼠的腫瘤組織中氧區(qū)域（圖 1B）；與已有的研究結(jié)果一致，舒尼替尼處理后腫明顯減少（圖 1C），以上結(jié)果說明舒尼替尼治療后可以造成腫境。

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文800 μm); C. Vascular density was stained by CD31 antibody. (Scale bar, 0.5 cm).2.2 乏氧增強體內(nèi)腫瘤干細胞的干性既往研究證實，乏氧可以通過上調(diào)諸如 OCT4、SOX2 和 NANOG 等干性基因的表達，這些基因在維持干細胞自我更新或調(diào)節(jié)細胞自我分化中起到重要作用。為了檢測體內(nèi)乏氧能否增強腫瘤細胞干細胞樣表型，，我們用 Real-time PCR,Western blot 檢測腫瘤組織內(nèi)干性相關(guān)基因，結(jié)果顯示舒尼替尼治療組干性基因Sox2，Oct3/4 和 KLF4 表達升高（圖 2A）。乙醛脫氫酶 1（ALDH1）通常用于標記乳腺癌干細胞樣細胞[48]，因此我們通過 Real-time PCR, Westernblot 檢測了ALDH1 的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼治療組 ALDH1 在基因和蛋白水平上表達均顯著升高（圖 2B）。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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5 黃華t

本文編號：2636957