【摘要】：肝細(xì)胞具有獨(dú)特的極性結(jié)構(gòu),其中兩個(gè)相鄰細(xì)胞形成膽汁腔面(即頂端膜),其余區(qū)域?yàn)楦]狀間隙面(即基底側(cè)膜)。肝細(xì)胞極性的建立和維持對(duì)于正常細(xì)胞的生理功能和肝組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,該事件需要細(xì)胞粘附分子、極性蛋白復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸體系共同協(xié)調(diào)完成。越來越多的證據(jù)表明,上皮細(xì)胞極性的丟失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞粘附減弱和過度增殖,誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,如肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。然而,導(dǎo)致HCC進(jìn)展的肝細(xì)胞極性結(jié)構(gòu)改變及其分子機(jī)制仍未知。CD147是I型跨膜糖蛋白,在肝癌細(xì)胞高度表達(dá),而CD147是否也表達(dá)在肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及與肝癌進(jìn)展的相關(guān)性并未完全揭示。我們之前的報(bào)道表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transform growth factor-1,TGF-β1)-CD147信號(hào)誘導(dǎo)EMT,促進(jìn)HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在犬腎上皮細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)中,研究者鑒定出了CD147的基底側(cè)膜分選信號(hào),為C末端結(jié)構(gòu)域中的亮氨酸-252。攜帶基底側(cè)膜定位信號(hào)的CD147有助于單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT 1)/CD147異源復(fù)合物在腎細(xì)胞基底側(cè)膜的極性靶向定位。但是,關(guān)于在肝細(xì)胞上,CD147是否具有極性分布,以及在肝癌進(jìn)展中是否參與了肝細(xì)胞極性的丟失,目前還未知。針對(duì)上述科學(xué)問題,本研究旨在明確1)肝癌進(jìn)展中CD147在肝臟組織中的細(xì)胞表達(dá)譜;2)CD147在肝細(xì)胞膜上的極性分布及其臨床意義;3)CD147表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞極性的影響及其促癌的分子調(diào)控機(jī)制。本研究分為三部分。第一部分:肝癌進(jìn)展中CD147的肝臟細(xì)胞表達(dá)譜研究。我們采用二乙基亞硝胺/苯巴比妥(N-diethylnitrosamine/phenobarbital,DEN/PB)兩階段誘導(dǎo)方式,體內(nèi)探索HCC時(shí)間依賴性的發(fā)展過程。DEN/PB誘導(dǎo)第五個(gè)月,腫瘤形成,并伴隨誘導(dǎo)而逐漸發(fā)展。給藥后第1-12個(gè)月收集肝臟樣本,明確CD147在肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的定位。免疫組織化學(xué)分析顯示在DEN/PB誘導(dǎo)的第1-8個(gè)月期間,CD147在肝臟腫瘤中表達(dá)上調(diào)。CD147的表達(dá)分別與CK18(肝細(xì)胞標(biāo)志物,r=0.7857,P=0.0279),CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,r=0.9048,P=0.0046),和CD68(巨噬細(xì)胞標(biāo)志物,r=0.7619,P=0.0368)呈正相關(guān)。在DEN/PB誘導(dǎo)起始和腫瘤形成的早期階段,CD147與α-SMA之間也存在正相關(guān)(r=0.8857,P=0.0333)。免疫熒光和熒光原位雜交顯示CD147與CK18、CD31、α-SMA和CD68具有共定位。此外,在DEN/PB誘導(dǎo)的HCC發(fā)展中,CD147與微血管密度(r=0.7857,P=0.0279)、Ki-67(r=0.9341,P=0.0022)呈顯著性正相關(guān)。第二部分:CD147誘導(dǎo)肝細(xì)胞極性丟失的作用研究。在3D人肝癌細(xì)胞球(HepG2)和小鼠肝癌組織中,免疫熒光顯示:CD147與基底側(cè)膜標(biāo)志物鈉離子/�；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na~+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、integrinβ1具有共定位,而與頂端膜標(biāo)志物多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)、F-actin沒有共定位,即CD147位于肝細(xì)胞的基底側(cè)膜。在192例人肝癌組織中,通過CD147免疫組織化學(xué)染色,將其分為極性分布和非極性分布,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:CD147極性分布與HCC分化程度呈正相關(guān)(r=0.2060,P=0.004);生存分析顯示,具有CD147極性分布的HCC患者的總體生存率明顯高于CD147非極性患者(P=0.021)�？梢�,CD147在肝細(xì)胞上的極性分布具有臨床意義。為了闡明CD147表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞極性的影響,我們建立了CD147過表達(dá)和CD147干涉的HCC細(xì)胞系。利用這些細(xì)胞系,證實(shí)CD147促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的肝細(xì)胞極性丟失,以及E-cadherin、Par3表達(dá)的下調(diào)。更重要的,CD147過表達(dá)可以直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞極性丟失。第三部分:CD147過表達(dá)誘導(dǎo)肝細(xì)胞極性丟失的分子機(jī)制研究。在HCC細(xì)胞中,CD147過表達(dá)誘導(dǎo)E-cadherin的內(nèi)吞和下調(diào),同時(shí)Par3表達(dá)下調(diào),進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞去極化。相反,干涉和敲除CD147后,E-cadherin和Par3表達(dá)上調(diào)。探究其機(jī)制我們發(fā)現(xiàn):CD147過表達(dá)促進(jìn)Src活化,隨后招募泛素連接酶Hakai,使E-cadherin泛素化和溶酶體降解,導(dǎo)致Par3表達(dá)的減少和β-catenin的入核。該信號(hào)通路是通過CD147與integrinβ1的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來啟動(dòng),其阻斷fibronectin的Arg-Gly-Asp序列與integrinβ1之間的相互作用。加入靶向integrinα5和β1特異性抗體,會(huì)逆轉(zhuǎn)由CD147過表達(dá)引起的E-cadherin和Par3表達(dá)的降低。人HCC組織的mRNA結(jié)果顯示:CD147的表達(dá)和Par3(r=-0.3230,P=0.0221)、E-cadherin(r=-0.2824,P=0.0469)呈負(fù)相關(guān);CD147的表達(dá)與integrinα5(r=0.2957,P=0.0371)、integrinβ1(r=0.3043,P=0.0317)呈正相關(guān)。上述所有結(jié)果都表明了由癌相關(guān)基因CD147調(diào)控的頂端-基底(apical-basal)細(xì)胞極性機(jī)制在HCC進(jìn)展中的重要作用,即1)CD147在肝實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并參與DEN/PB誘導(dǎo)的HCC發(fā)展中的血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖。2)CD147位于人肝細(xì)胞的基底側(cè)膜,這與HCC進(jìn)展密切相關(guān)。3)CD147通過“CD147-integrinα5β1-E-cadherin泛素化-Par3降低和β-catenin入核”的信號(hào)通路調(diào)控肝細(xì)胞極性。本研究補(bǔ)充了HCC發(fā)展的機(jī)制,并提供了基于靶向CD147治療HCC的新理論。
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文突變，以及 mTOR（mammalian target of rapamycin）信號(hào)被破壞[6,7]；胰島素樣生長(zhǎng)因子受體 1（insulin-like growth factor receptor 1，IGFR 1）信號(hào)被激活；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）和 c-MET 信號(hào)通路的失調(diào)也很常見的[5]。另外，HCC 中，還發(fā)現(xiàn) β-catenin 的激活、Wnt 受體的過表達(dá)或 E-cadherin 的失活，促使 Wnt 信號(hào)通路被激活。

細(xì)胞形態(tài)形成，胚胎發(fā)生中的細(xì)胞遷移，神經(jīng)沖動(dòng)沿軸突的正確傳遞，免疫細(xì)胞的趨化性以及分子穿過上皮片層的定向運(yùn)輸[55]。我們研究所關(guān)注的是上皮細(xì)胞中的頂端/基底極性（apico-basal，AB）排列，但也存在其他類型的極性，即平面細(xì)胞極性（planar cell polarity，PCP），，其在上皮細(xì)胞中垂直于 AB 軸，前后極性（front-rear，F(xiàn)R 或 anterior-posterior，AP），其存在于遷移細(xì)胞、神經(jīng)元和進(jìn)行不對(duì)稱分裂的細(xì)胞中，常在間質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮作用。1. 上皮細(xì)胞極性結(jié)構(gòu)上皮細(xì)胞是構(gòu)成哺乳動(dòng)物體內(nèi)大多數(shù)器官的基礎(chǔ)，約占人類所有癌癥中來源的90％。正常上皮細(xì)胞的極化是通過細(xì)胞組分沿著內(nèi)部頂端-基側(cè)軸的不對(duì)稱分布而形成的，分為頂端區(qū)域，其面向內(nèi)腔，以及基底側(cè)膜區(qū)域，其側(cè)膜與相鄰細(xì)胞連接，底部附著于基底膜，兩個(gè)區(qū)域由緊密連接（tight junction，TJ）分隔而成（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

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