發(fā)布時間：2020-04-06 03:44

【摘要】：目的:舌鱗狀細(xì)胞癌(Tougue squamous cell carcinoma,TSCC)是頭頸頜面部一種常見的惡性腫瘤,具有高侵襲性的生長方式和早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特性。盡管舌癌的治療包括手術(shù)、放療和化療已取得了重大進展,但因舌鱗癌手術(shù)采取舌體擴大切除及選擇性頸淋巴結(jié)清掃,術(shù)后常造成患者的咀嚼和言語等功能障礙和面部容貌的畸形,極大地影響患者術(shù)后的生存質(zhì)量和心理健康。新的治療方法如基因治療、靶向治療和生物治療等因有可以選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞而極少損傷人體正常細(xì)胞的優(yōu)勢越來越受到人們的關(guān)注。舌鱗狀細(xì)胞癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身的特性,還依賴于腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境中的一些因素。因此,影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境因素成為現(xiàn)階段腫瘤治療的研究熱點。炎癥與腫瘤的關(guān)系在腫瘤學(xué)的研究中越來越受到重視。腫瘤微環(huán)境里存在的炎癥調(diào)節(jié)因子能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如其可以促進惡性腫瘤細(xì)胞的生長,加快其分裂增殖,促血管增生和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,并且降低機體的固有性免疫和獲得性免疫能力,改變機體對激素和化療藥物的敏感性。微環(huán)境中的炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)、干擾素等對腫瘤細(xì)胞的生長增殖、侵襲、遷移和凋亡具有重要的調(diào)控作用。炎癥調(diào)節(jié)因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要的調(diào)控作用使得炎癥介質(zhì)成為腫瘤治療的重要靶點。如同其它炎癥介質(zhì),C反應(yīng)蛋白(C reactive protein,CRP)是一種機體發(fā)生各種急慢性炎癥或受到損傷后的敏感的急性時相反應(yīng)蛋白。CRP在肝臟中合成后通過血液循環(huán)分泌到各個組織器官,通過與配體結(jié)合來識別多種內(nèi)源性(如壞死衰老癌變的細(xì)胞)和外源性物質(zhì)(如細(xì)菌)而顯現(xiàn)出大量的生物活性。CRP與感染性炎癥及心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)�，F(xiàn)階段國內(nèi)外很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),癌癥患者血清中CRP的濃度明顯高于正常人,其濃度升高的程度與腫瘤大小、臨床分期及病理分型有一定的相關(guān)性,而且CRP血清水平還與治療療效和術(shù)后復(fù)發(fā)率有關(guān)。然而現(xiàn)階段對CRP的研究僅限于血清中CRP的濃度與腫瘤關(guān)系的統(tǒng)計學(xué)研究,腫瘤微環(huán)境中的CRP對腫瘤細(xì)胞的直接作用研究很少。因此,本課題以CRP為靶因子,利用免疫組織化學(xué)研究CRP在舌鱗癌組織和細(xì)胞中的表達分布情況,并將外源性的重組人CRP與舌鱗癌細(xì)胞共培養(yǎng),采用CCK-8(Cell counting kit-8)、Transwell 小室、劃痕實驗、Annexin V-FITC/PI 雙染、Western Blot及免疫共沉淀等技術(shù)研究其對舌鱗癌細(xì)胞生長增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和分子調(diào)節(jié)機制,以期為舌鱗癌的臨床治療提供新的治療思路和實驗數(shù)據(jù)。材料與方法:本課題分為三部分:第一部分:研究CRP在舌鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達實驗一:CRP在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達收集舌鱗癌組織42例,制作石蠟切片,梯度酒精入水,0.1%胰酶消化液抗原修復(fù),滴加3%雙氧水,正常山羊血清封閉,CRP抗體4℃濕盒孵育過夜。滴加生物素化二抗工作液和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,封片。用Image Pro Plus 6.0軟件測定累積光密度(IOD SUM)及目標(biāo)區(qū)域面積(area),計算平均光密度值(mean density),mean density=(IOD SUM)/area。收集并整理每個患者的臨床資料,采用單因素方差分析或t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗二:CRP在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達1.舌鱗癌細(xì)胞分泌CRP的研究CAL27、SCC4及SCC25細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測培養(yǎng)基中CRP的含量。2.Western blot檢測舌鱗癌細(xì)胞中CRP的表達CAL27、SCC4及SCC25細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h,提取細(xì)胞總蛋白,蛋白含量測定,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫反應(yīng),顯影。第二部分:研究CRP對舌鱗癌細(xì)胞生長增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學(xué)行為的作用1.CCK-8檢測細(xì)胞增殖在96孔板中加入細(xì)胞(CAL27和SCC4細(xì)胞)懸液(100μl/孔,細(xì)胞密度為3.5×104個/ml),檢測CRP效應(yīng)濃度實驗采用含有不同濃度CRP(0、5、10、20、30 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞24 h。檢測CRP作用時間實驗采用含有不同濃度(5、10、20μg/ml)CRP 的 DMEM,分別培養(yǎng)細(xì)胞 48、36、24、12、6、0h。每孔中加入10μlCCK-8溶液,用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度值。2.Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲CAL27細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中饑餓24 h,同化處理。在培養(yǎng)室的上腔分別加入200 μμl細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為4×105個/ml),下腔中分別加入無血清、含10μμg/ml CRP及10%FBS的DMEM各500μ1,培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡下計數(shù)。3.劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移在6孔板中加入CAL27細(xì)胞懸液(2 ml/孔,細(xì)胞密度為4×105個/ml),待細(xì)胞生長融合至90%時,用200 μl的槍頭在每孔底部劃痕。每孔中加入不同條件的培養(yǎng)基(無血清DMEM、無血清DMEM+CRP(10 μg/ml)、含有10%FBS DMEM),分別在0、6、12、18h時取樣,拍照,測量。4.Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡在6孔板中加入CAL27和SCC4細(xì)胞懸液,采用不同條件的培養(yǎng)基(無血清DMEM、無血清DMEM+CRP(10μg/ml);正常培養(yǎng)基、含CRP的正常培養(yǎng)基、含順鉑(Cisplatin,DDP;2 μg/ml)的正常培養(yǎng)基、含DDP和CRP的正常培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h。按照凋亡檢測試劑盒說明書加入凋亡試劑后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。5.Western blot 檢測細(xì)胞核增殖抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達在6孔板中加入CAL27細(xì)胞懸液,采用含有CRP(10 μg/ml)的培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)48、36、24、12、6、Oh。采用Western blot檢測PCNA的表達變化。第三部分:研究CRP作用舌鱗癌細(xì)胞過程中可能結(jié)合的受體及激發(fā)的信號調(diào)節(jié)通路實驗一:CRP作用舌鱗癌細(xì)胞CAL27過程中可能結(jié)合的受體1.免疫熒光染色檢測CAL27細(xì)胞表面受體的表達細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定,0.2%Triton X 100通透,血清封閉液封閉,滴加一抗(Fcγ Ⅰ、FcγⅡ、FcγⅢ)4℃濕盒孵育過夜。暗室中滴加熒光二抗和DAPI,封片,熒光顯微鏡下觀察。2.免疫共沉淀檢測CRP與CAL27細(xì)胞表面受體的結(jié)合細(xì)胞生長融合至100%時,實驗組加入CRP(25 μg/ml)孵育30 min,對照組中加入PBS。裂解細(xì)胞提取蛋白,加入兔來源的CRP抗體后,再加入Agarose A/G進行結(jié)合反應(yīng),蛋白變性。采用Westernblot檢測所形成的免疫復(fù)合物。實驗二:CRP作用舌癌細(xì)胞CAL27過程中所激發(fā)的AKT/mTOR/S6信號通路的研究1.Western Blot檢測AKT/mTOR/S6信號通路蛋白的表達變化在6孔板中加入細(xì)胞懸液,待細(xì)胞生長融合至70%左右后,采用含有CRP(10μg/ml)的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)胞 0、15、30、60、120 和 0、30、60、120、180、240 min。采用 Western Blot 檢測 pAKT、pmTOR、pS6、pNF-KB、pERK 蛋白的表達變化。2.CCK-8檢測在培養(yǎng)基中加入mTOR的抑制劑-雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)后細(xì)胞的增殖狀況在96孔板中加入細(xì)胞懸液,采用含有不同成分的培養(yǎng)基(DMEM+DMSO,DMEM+CRP,DMEM+CRP+RAPA,DMEM+RAPA),培養(yǎng) 48、36、24、12、6、0h。采用CCK-8檢測細(xì)胞的增殖狀況。雷帕霉素(RAPA)的終濃度為2 μm/L。3.Western Blot檢測在培養(yǎng)基中加入雷帕霉素后PCNA的表達變化常規(guī)細(xì)胞鋪板,加入含有不同成分(DMEM+DMSO,DMEM+CRP,DMEM+CRP+RAPA,DMEM+RAPA)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。Western Blot 檢測 PCNA的表達變化。實驗三:CRP作用舌癌細(xì)胞CAL27過程中所激發(fā)的Caspase 3/9凋亡信號通路的研究常規(guī)細(xì)胞鋪板,分別加入含2 μg/ml DDP和PBS、含2 μg/ml DDP、含2 μg/ml DDP和10 μg ml CRP 的 DMEM,培養(yǎng) CAL27 細(xì)胞 24 h。Western Blot 檢測Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 的表達變化。結(jié)果:1.CRP在舌鱗癌組織中呈陽性表達,而且舌鱗癌細(xì)胞可能產(chǎn)生及分泌CRP1.1.CRP在癌旁正常組織中無表達,在舌鱗癌組織中呈陽性表達免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,CRP在癌旁正常組織中無表達,在舌鱗癌組織中呈現(xiàn)陽性表達,CRP主要表達于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。CRP的表達強弱與腫瘤大小、病理分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而與年齡、性別無關(guān)。CRP在中低分化的舌癌組織中表達強于在高分化的舌癌組織中,而且,CRP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的舌癌組織中表達更強。1.2.舌鱗癌細(xì)胞可能產(chǎn)生及分泌CRPELISA結(jié)果顯示不同舌鱗癌細(xì)胞系培養(yǎng)基中均含有不同含量的微量CRP,而在無細(xì)胞的培養(yǎng)基中沒有檢測到CRP。Western Blot結(jié)果顯示在不同舌鱗癌細(xì)胞中都有CRP的表達。2.CRP促進舌鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,降低饑餓和DDP誘導(dǎo)的舌癌細(xì)胞的凋亡CCK-8結(jié)果顯示CRP能明顯促進CAL27和SCC4細(xì)胞的增殖,并呈劑量及時間依賴性。CRP濃度在5μg/ml和10 μg/ml時對細(xì)胞的促增殖作用逐漸增加,在10 μg/ml時其對細(xì)胞的促增殖作用最明顯,增加CRP濃度至20 μg/ml和30 μg/ml時,其增殖效果無明顯增加。采用濃度為5、10和20 μg/ml CRP作用舌癌細(xì)胞24 h時增殖作用最明顯,隨著作用時間延長至36 h和48 h,CRP的促增殖效應(yīng)減低。Western Blot結(jié)果顯示PCNA在10μg/ml CRP作用24 h時表達量最高。Transwell小室和劃痕實驗顯示CRP能明顯促進舌癌細(xì)胞CAL27的侵襲和遷移。10 μg/ml CRP作用舌癌細(xì)胞24 h后,穿過多聚碳酸膜的細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性空白對照組。10μg/mlCRP作用舌癌細(xì)胞6h、12h和18h后,細(xì)胞遷移的距離分別是空白對照組的1.3、2和1.5倍。Annexin V-FITC/PI雙染顯示10 μg/ml CRP作用舌癌細(xì)胞CAL27和SCC4細(xì)胞24 h后,饑餓和DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率降低了接近50%。3.CRP可以結(jié)合CAL27細(xì)胞表面的Fcγ Ⅰ受體,上調(diào)AKT/mTOR/S6增殖信號通路,下調(diào)Caspase-3/9凋亡信號通路3.1.CRP可以結(jié)合CAL27細(xì)胞表面的Fcγ Ⅰ受體免疫熒光顯示CAL27細(xì)胞表面表達FcγⅠ、FcγⅡ和FcγⅢ受體。免疫共沉淀顯示CRP可以結(jié)合Fcγ Ⅰ受體形成復(fù)合物蛋白沉淀。3.2.CRP可以上調(diào)AKT/mTOR/S6增殖信號通路Western blot 結(jié)果顯示 10 μg/ml CRP 作用 CAL27 細(xì)胞到 15、30、60 min 時,pAKT和pmTOR表達逐漸升高,pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值逐漸升高,當(dāng)作用時間延長至120 min時,pAKT和pmTOR表達下調(diào),pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值降低。CRP作用到30 min時,pS6表達上調(diào),pS6/S6的值升高近0.5倍,當(dāng)作用時間延長至60 min和120 min時,pS6表達減少,pS6/S6的值降低。pNF-KB在CRP作用過程中表達量沒有明顯變化。在CRP的作用時間從0 min延長至240 min時,pERK/ERK逐漸降低。在培養(yǎng)基中加入雷帕霉素后,CCK-8結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖明顯低于只加入CRP組。Western Blot結(jié)果顯示加入雷帕霉素組,PCNA蛋白的表達量明顯低于CRP組。3.3.CRP可以下調(diào)Caspase-3/9凋亡信號通路Western Blot結(jié)果顯示加入CRP培養(yǎng)24 h后,Cleaved Caspase-3蛋白的表達減少,Cleaved PARP和Cleaved Caspase-9蛋白的表達也減少。結(jié)論:1.CRP可能在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的促進作用。2.CRP能促進舌鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,降低饑餓和DDP誘導(dǎo)的舌癌細(xì)胞的凋亡率。3.CRP可能通過結(jié)合舌癌細(xì)胞表面的Fcγ Ⅰ受體來影響舌癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。4.CRP可能通過AKT/mTOR/S6信號通路促進舌癌細(xì)胞CAL27的增殖,從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。5.CRP可能通過減少Caspase-3/9蛋白的活化降低DDP誘導(dǎo)的CAL27細(xì)胞的凋亡率。
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑結(jié)果逡逑１．ＣＲＰ在癌旁正常舌體組織及舌癌組織中的表達逡逑免疫組化結(jié)果顯示ＣＲＰ在正常舌體組織中無表達，而在舌癌組織中呈陽性逡逑表達，但表達強弱不一致。ＣＲＰ陽性反應(yīng)物呈棕黃色或棕褐色顆粒樣沉積，主逡逑要沉積于細(xì)胞質(zhì)中（圖１－１）。逡逑

ＥＬＩＳＡ結(jié)果顯示不同舌癌細(xì)胞系培養(yǎng)基中含有不同含量的微量ＣＲＰ而在無逡逑細(xì)胞的培養(yǎng)基中沒有檢測到ＣＲＰ。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ結(jié)果顯示在不同舌鱗癌細(xì)胞中都逡逑有ＣＲＰ蛋白的表達（圖１－２）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑０．１０－１逡逑＿邋０．０８－邐＿ｍ＿邐ＣＡＬ２７邋ＳＣＣ４邋ＳＣＣ２５逡逑ｇ邋０．０６－逡逑＾邐ｍｍｍ邋ＣＲＰ逡逑0．０２＿邐１邋＂Ｔ邋｜邐Ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑0．00Ｊ——，邐邐，，一＂￣■邋■邋ｒ」—逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＣＡＬ２７邋ＳＣＣ４邋ＳＣＣ２５逡逑圖１－２．舌淲癌細(xì)胞可以分泌ＣＲＰ。（Ａ）邋ＥＬＩＳＡ結(jié)果顯示不同舌癌細(xì)胞系培養(yǎng)基中含有不逡逑同含量的微量ＣＲＰ而在無細(xì)胞的培養(yǎng)基中沒有檢測到ＣＲＰ。（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ顯示在不同逡逑舌癌細(xì)胞中都有ＣＲＰ蛋白的表達。逡逑３５逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.86

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 高翔,左桂蘭,郭林;血清C反應(yīng)蛋白在惡性腫瘤中的臨床應(yīng)用[J];診斷學(xué)理論與實踐;2004年01期

2 蔣曉婷,陳永健,劉建棟;血清C反應(yīng)蛋白水平預(yù)測胃癌惡性程度的研究[J];腫瘤學(xué)雜志;2001年05期

本文編號：2615958