【摘要】：惡性腫瘤對人類的健康和生命產(chǎn)生了巨大威脅,是中國乃至全世界主要的人口死亡原因之一。根據(jù)我國最新癌癥統(tǒng)計學數(shù)據(jù),肺癌是當今中國死亡率最高的惡性腫瘤,晚期肺癌五年生存率不足15%。根據(jù)病理類型,肺癌可分為非小細胞肺癌(Non-small-cell Lung Cancer,NSCLC)及小細胞肺癌(Small-cell Lung Cancer,SCLC),其中NSCLC是肺癌的主要組成部分,占肺癌總數(shù)的80-85%。由于缺乏典型的臨床表現(xiàn),NSCLC在診斷初期往往已經(jīng)是晚期。近年來,盡管NSCLC的治療在手術(shù)、放療及化療中都取得了一定的進展,但五年生存率仍較低。乏氧是惡性實體瘤的重要生物學特性之一。近二十年來的臨床研究已經(jīng)明確證實幾乎所有惡性實體瘤中都存在一定范圍的乏氧區(qū)域,是局部晚期實體瘤的特征性病理生理特征之一。乏氧在腫瘤中產(chǎn)生的原因是多樣化的,但其根源在于氧氣供給不足以及耗氧量增加。在正常組織中,氧氣的供給與組織代謝的需求處于平衡狀態(tài),但在惡性腫瘤中,由于沒有完善的血供以及腫瘤的高代謝狀態(tài),最終導致了腫瘤乏氧。同時,由于腫瘤本身以及化療相關(guān)性貧血,進一步使血液中氧含量下降以及腫瘤供氧不足。乏氧會對腫瘤細胞產(chǎn)生巨大影響,比如會提高腫瘤基因組不穩(wěn)定性、促進腫瘤血管生成、引起腫瘤轉(zhuǎn)移、導致放化療耐受以及產(chǎn)生不良預后等。與乏氧相對應的則是氧化應激,但二者之間并不矛盾。氧氣是線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate,ATP)所必須的,同時,由于氧氣分子活潑的化學活性,極易形成活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)。當細胞處于乏氧狀態(tài)時,由于能量及氧氣缺乏,線粒體復合體III中ROS產(chǎn)生急劇增加。ROS是細胞代謝中的正常產(chǎn)物,主要包括超氧化物、過氧化物和氫氧自由基等。線粒體代謝過程中電子傳遞鏈是ROS的主要來源。ROS在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,在正常組織中,細胞內(nèi)ROS水平通過氧化還原機制控制在平衡狀態(tài),而腫瘤細胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生速度遠遠高于正常細胞。一定水平的ROS會增加腫瘤細胞突變頻率,激活增殖相關(guān)信號通路,促進腫瘤進展。盡管ROS在一定程度上促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但當ROS水平過高時,則會導致氧化應激而對腫瘤細胞產(chǎn)生致命性損傷,從而成為腫瘤治療的靶點之一。氧化還原水平的平衡取決于ROS的產(chǎn)生速率與清除系統(tǒng)的清除能力。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、硫氧還蛋白、谷氧還蛋白等多種ROS清除劑在氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在前期關(guān)于乏氧的研究中,我們發(fā)現(xiàn)乏氧誘導因子-1的表達與肝激酶B1(Liver Kinase B1,LKB1)信號通路密切相關(guān)。LKB1是細胞內(nèi)維持能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子,LKB1單獨突變被認為不能誘導肺癌的出現(xiàn),但KRAS-LKB1共突變(KL腫瘤)則會誘導肺腺癌、鱗癌或大細胞癌。在關(guān)于KRAS腫瘤的研究中,曾有學者提出將KRAS腫瘤根據(jù)共突變類型分成三個亞類,KRAS-LKB1共突變是其中重要的一種亞型。KL腫瘤比KRAS突變腫瘤(K腫瘤)生長更快,更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,而KL腫瘤通常合并有KEAP1的共突變。KEAP1是細胞氧化應激反應中的重要分子,作為E3泛素連接酶的適配蛋白,正常情況下KEAP1在細胞質(zhì)中結(jié)合到NRF2上并誘導其泛素化,通過蛋白酶體途徑降解NRF2,進而影響抗氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,其中最重要的是谷氨酰胺代謝相關(guān)通路基因表達的改變。我們研究發(fā)現(xiàn)LKB1突變腫瘤抗氧化應激能力增強,這可能與LKB1突變合并KEAP1突變或NRF2上調(diào)進而引起谷氨酰胺代謝增強密切相關(guān)。谷氨酰胺的代謝在腫瘤的進展過程中非常關(guān)鍵,其重要性主要體現(xiàn)在其與葡萄糖一樣,能夠為腫瘤細胞的生長提供大量的ATP,并且是生成細胞內(nèi)主要還原產(chǎn)物GSH的前體氨基酸。正常細胞及腫瘤細胞均需利用葡萄糖及谷氨酰胺,但需求量存在很大差別。腫瘤細胞對谷氨酰胺的需求遠高于正常細胞。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)催化作用下形成谷氨酸是谷氨酰胺代謝的首要步驟。目前,GLS抑制劑已經(jīng)進入臨床I期實驗,但并非對所有患者均有效,尋找合適的生物標記物指導GLS抑制劑的臨床應用,對該藥在臨床上的廣泛應用至關(guān)重要。目前GLS抑制劑的作用機制仍不清楚。根據(jù)谷氨酰胺在細胞中的作用,我們推測GLS抑制劑能夠誘導能量應激及氧化應激,進而起到抗腫瘤作用。鑒于LKB1在腫瘤細胞中維持能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)中的重要作用,我們進一步探索了LKB1及其他突變對GLS抑制劑抗腫瘤作用的影響。第一部分 紅細胞相關(guān)指數(shù)對非小細胞肺癌患者預后影響的研究[研究目的]1.以乏氧誘因為出發(fā)點,分析NSCLC患者術(shù)前紅細胞相關(guān)指數(shù)對患者預后的影響;2.通過多因素分析,尋找紅細胞相關(guān)指數(shù)中潛在的NSCLC獨立預后因子;3.探索該指標與NSCLC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。[研究方法]1.入組患者:本研究選取了從2006年1月到2009年12月在山東大學附屬省立醫(yī)院胸外科行肺癌根治術(shù)的患者,根據(jù)入組條件篩選患者入組。2.資料收集:收集患者的姓名、性別、血常規(guī)檢查(入院后首次檢查結(jié)果為準)、吸煙史、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、術(shù)式等信息。通過山東大學附屬省立醫(yī)院病案管理系統(tǒng)獲取患者臨床信息及聯(lián)系方式。通過電話回訪的方式進行隨訪。3.統(tǒng)計方法:研究首要終點為患者總生存期(Overall Survival,OS),次要研究終點為無進展生存期(Recurrence Free Survival,RFS)。Kaplan-Meier法分析單因素對患者預后的影響并繪制生存曲線。通過log-rank時序檢驗比較兩組之間的差異。通過受試者工作特征曲線比較不同指標對預后的預測能力并確定最佳界值。通過χ2檢驗(必要時使用Fisher確切檢驗)或t檢驗分析紅細胞相關(guān)指數(shù)與臨床病理特征之間的關(guān)系。預后因子的多因素分析通過Cox風險回歸模型進行。單因素分析中p0.05的變量進入多因素分析。當p0.05時認為具有統(tǒng)計學差異(雙側(cè)檢驗)。[研究結(jié)果]1.患者基本特征:本研究共納入患者649例,男性患者456例,女性患者193例。在患者的病理分期分布中,早期患者居多,Ⅰ/Ⅱ期患者占研究總?cè)藬?shù)的72.9%,Ⅲ期患者占27.1%,無Ⅳ期患者入組;2.單因素分析:患者的性別、年齡、術(shù)式、腫瘤分化程度、N分期、T分期、腫瘤大小、血紅蛋白(Hemoglobin,HGB)、紅細胞壓積(Hematocrit,HCT)、平均紅細胞體積(Mean Corpuscular Volume,MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MeanCorpuscularHemoglobin,MCH)以及平均紅細胞血紅蛋白濃度(Mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)與患者預后相關(guān)。紅細胞相關(guān)指數(shù)中,較高水平的HGB、HCT、MCHC、MCV以及MCH與NSCLC患者較好的OS相關(guān)。同時,在對RFS的研究中,較高水平的MCH、MCV以及MCHC與較好的RFS也密切相關(guān),但HGB與HCT對RFS影響無統(tǒng)計學意義;3.多因素分析:在利用其它明確預后因子校正后,只有MCHC既是OS的獨立預后因子(p=0.032),又是RFS的獨立預后因子(p=0.010)。MCV僅僅是OS的獨立預后因子(p=0.018),但不是RFS的獨立預后因子(p=0.059)。其它紅細胞相關(guān)指標,如HCT、HGB以及MCH等僅在單因素分析中有意義,但在多因素分析中沒有意義,證明這些預后因子并非獨立預后因子;4.MCHC與臨床病理因素的相關(guān)性分析:低MCHC水平與男性(p=0.02)、較高吸煙指數(shù)(p=0.002)、較高T分期(p=0.018)以及較大腫瘤體積(p=0.004)密切相關(guān)。[研究結(jié)論]1.單因素分析中,MCHC、MCH及MCV均對NSCLC患者OS及RFS有影響,但HGB、HCT僅影響患者OS;2.在非貧血NSCLC患者中,MCHC是預測OS及RFS的獨立預后因子,MCV是預測OS的獨立預后因子,但不是預測RFS的獨立預后因子;3.低MCHC水平與男性、較高吸煙指數(shù)、較高T分期以及較大腫瘤體積密切相關(guān)。第二部分 能量及氧化應激對KRAS突變NSCLC治療作用研究[研究目的]1.LKB1與KEAP1/NRF2在維持細胞內(nèi)能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)中的作用;2.KEAP1/NRF2通路在LKB1缺失NSCLC中對能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用;3.LKB1及KEAP1/NRF2對谷氨酰胺代謝的調(diào)控及各突變類型細胞對谷氨酰胺的依賴性;4.GLS抑制劑對NSCLC治療作用;5.LKB1及KEAP1/NRF2通路對GLS抑制劑抗腫瘤作用的影響。[研究方法]1.利用腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)對KRAS突變NSCLC進行共突變分析,利用基因富集分析(Geneset Enrichment Analysis,GSEA)研究KEAP1突變對NSCLC可能的影響;2.利用慢病毒感染或CRISPR/cas9構(gòu)建穩(wěn)定過表達或敲除細胞系(LKB1及KEAP1過表達和KEAP1敲除),利用siRNA敲除NRF2;3.利用磺酰羅丹明B細胞染色法、克隆形成實驗及CellTiter-Glo檢測細胞增殖或細胞活力,利用BrdU及PI法檢測細胞周期,利用AnnexinV/7-AAD檢測細胞凋亡,利用DCFDA檢測細胞ROS水平,利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測蛋白表達,利用ATPlite檢測細胞內(nèi)ATP水平,利用相應試劑盒檢測細胞內(nèi)各種代謝產(chǎn)物含量,利用2-NBDG檢測細胞葡萄糖攝取水平。[研究結(jié)果]1.共突變分析顯示,在NSCLC中,KRAS與LKB1及LKB1與KEAP1之間存在明顯共突變;2.LKB1能夠維持腫瘤細胞能量及氧化還原穩(wěn)態(tài),LKB1缺失細胞對能量應激敏感但對氧化應激耐受;3.LKB1可以通過KEAP1非依賴性途徑調(diào)控NRF2的表達;4.LKB1及KEAP1共同調(diào)控谷氨酰胺代謝及細胞對谷氨酰胺的依賴性;5.GLS抑制劑CB-839及IACS-006274具有良好的抗腫瘤活性,能夠通過周期抑制引起腫瘤細胞增殖抑制,但不能誘導腫瘤細胞凋亡;6.GLS抑制劑能夠誘導腫瘤氧化應激及能量應激,且其腫瘤抑制作用能被丙酮酸及還原劑所挽救;7.GLS抑制劑可以完全抑制KRAS-LKB1-KEAP1腫瘤細胞的增殖,部分抑制KRAS-LKB1突變或KRAS-KEAP1突變腫瘤細胞的增殖,但幾乎不能抑制KRAS單獨突變腫瘤細胞的增殖。[研究結(jié)論]1.LKB1突變腫瘤能夠通過KEAP1突變或KEAP1非依賴途徑誘導上調(diào)NRF2的表達,并產(chǎn)生對谷氨酰胺的依賴;2.GLS抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用是通過誘導能量及氧化應激作用而產(chǎn)生的;3.GLS抑制劑對KRAS-LKB1-KEAP1共突變腫瘤效果最好,可能成為GLS抑制劑臨床用藥的生物標記物。
【圖文】：

能夠為腫瘤細胞的生長提供大量的ＡＴＰ，并且為大分子產(chǎn)物的合成提供中逡逑間產(chǎn)物［７２］。正常細胞及腫瘤細胞均需利用葡萄糖及谷氨酰胺，但需求量存在很大逡逑差別，如圖２所示，正常細胞利用葡萄糖通過氧化磷酸化作用生成ＡＴＰ及其他代逡逑謝產(chǎn)物，而腫瘤細胞通常利用糖酵解產(chǎn)生ＡＴＰ，，產(chǎn)能效率低，但產(chǎn)能速度快，因而逡逑對葡萄糖的需求量大于正常組織；而對于谷氨酰胺，正常細胞利用谷氨憸胺的量較逡逑少，而腫瘤細胞由于葡萄糖產(chǎn)能低而且細胞內(nèi)ＲＯＳ水平高，對谷氨酰胺的利用量逡逑遠高于正常組織［７３］。逡逑谷氨酰胺的代謝過程如圖３所示，谷氨酰胺通過ＡＳＣＴ２進入細胞后，部分谷逡逑氨酰胺進入線粒體，在線粒體中谷氨酰胺酶（Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，邋ＧＬＳ）作用下形成谷氨逡逑酸，部分谷氨酸會被從線粒體轉(zhuǎn)運出去用于ＧＳＨ的合成，維持細胞內(nèi)的氧化還原逡逑平衡，而另一部分則在線粒體中通過谷l#酸脫氫酶（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＤＨ邋）逡逑的作用形成ａ－酮戊二酸（ａ－Ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ邋ａｃｉｄ

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋ＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ．邋Ｕｎｄｅｒ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，邋ＫＥＡＰ１邋ｂｉｎｄｓ邋ｔｏ邋ａｎｄ邋ｄｅｇｒａｄｅｓ逡逑ＮＲＦ２邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｈｅ邋ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ邋ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｐａｔｈｗａｙ．邋Ｈｏｗｅｖｅｒ，邋ｕｎｄｅｒ邋ｓｔｒｅｓｓｅｄ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，邋ＮＲＦ２邋ｃａｎ逡逑ｂｅ邋ｒｅｌｅａｓｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｔｈｅ邋ｎｕｃｌｅｕｓ，邋ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ邋ｏｆ邋ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄｓ，邋ａｎｄ邋ｇｌｕｃｏｓｅ．逡逑Ｉ邋ＬａＣｔａｔｅ邋］邐｜逡逑Ｎｏｒｍａｌ邋ｃｅｌｌｓ邐邐邋Ｔｕｍｏｒ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ｗａｒｂｕｒｇ邋ｅｆｆｅｃｔ邋｜逡逑一、—一一一逡逑＾邐＿一ｅ邋叫 ｍｉｎｅ邐Ｌ、＿逡逑１邋＇逡逑圖２．正常及腫v:細胞對葡萄糖及谷氨酰胺的代謝差異。相對于正常細胞，腫瘤細胞利用更多的逡逑葡萄精及谷氬酰胺，尤其是谷氛酰胺的利用量遠遠高于正常細胞。腫癯細胞中ＧＬＳ的活性更高，逡逑生成的谷氛酸（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）可以進入三羧酸循環(huán)為腫癯細胞提供能量，也可以生成ＧＳＨ調(diào)控逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Yu-Zhen Zheng;Shu-Qin Dai;Wei Li;Xun Cao;Yong Li;Lan-Jun Zhang;Jian-Hua Fu;JunYe Wang;;Prognostic value of preoperative mean corpuscular volume in esophageal squamous cell carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2013年18期

2 李立明,饒克勤,孔靈芝,姚崇華,向紅丁,翟鳳英,馬冠生,楊曉光,中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查技術(shù)執(zhí)行組;中國居民2002年營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查[J];中華流行病學雜志;2005年07期

本文編號：2610989