【摘要】：第一部分HSF1在人垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)及其臨床意義目的探究HSF1在人垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤中的表達(dá)及其潛在的臨床意義方法從馬普學(xué)會精神醫(yī)學(xué)中心臨床神經(jīng)內(nèi)分泌實驗室標(biāo)本庫中收集的47例垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤和4例正常人垂體組織標(biāo)本納入此項研究。使用免疫組織化學(xué)染色的方法在石蠟組織切片中進(jìn)行HSF1的染色。使用半定量方法評估組化染色的強度。使用Graph Pad Prism 7.0進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)及HSF1表達(dá)水平的統(tǒng)計分析。結(jié)果47例垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤中共3例(6.38%)為男性患者,其余44例(93.62%)皆為女性患者。在39例已知腫瘤直徑的病例當(dāng)中,14例(35.90%)為大腺瘤(平均腫瘤直徑15.86±4.67mm),25例(64.10%)為微腺瘤(平均腫瘤直徑7.68±1.91mm),其中3例大腺瘤、1例微腺瘤及1例腫瘤直徑未知病例為侵襲性腫瘤。主要激素水平如下:上午9點血清皮質(zhì)醇水平827.2±290.4 nmol/ml,夜晚12點血清皮質(zhì)醇水平653±347.7 nmol/ml,24小時尿游離皮質(zhì)醇2488.6±1932.99 nmol/ml,上午9點ACTH水平99.77±52.23ng/ml。4例正常垂體組織及47例ACTH腺瘤中均可檢測出HSF1陽性染色細(xì)胞。通過半定量分析HSF1的染色強度,26例ACTH腺瘤(55.31%)中HSF1的染色強度高于正常垂體組織,21例ACTH腺瘤(44.69%)中的HSF1染色強度與正常垂體相近。通過統(tǒng)計分析,未能發(fā)現(xiàn)HSF1的表達(dá)水平與患者性別(p=0.8382)、腫瘤侵襲性(p=0.2374)、上午9點血清皮質(zhì)醇水平(p=0.4627)、上午9點ACTH水平(p=0.6679)、24小時尿游離皮質(zhì)醇(p=0.9048)、腫瘤直徑(p=0.5581)有顯著相關(guān)性。結(jié)論HSF1在人ACTH腺瘤中差異性表達(dá),但普遍高于正常垂體組織,其表達(dá)水平對患者的激素水平及腫瘤特性并沒有顯著的關(guān)聯(lián)。第二部分HSF1在促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤細(xì)胞模型中的活化狀態(tài)及其對細(xì)胞增殖和激素分泌的影響目的探究HSF1在促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤細(xì)胞模型中的活化狀態(tài)及抑制HSF1對細(xì)胞增殖以及激素分泌的影響方法使用Western Blot和HSE-Luc報告基因檢測方法來檢測At T20細(xì)胞對熱休克刺激及HSF1抑制劑KRIBB11的反應(yīng)。Cell Titer Glo試劑盒及細(xì)胞絕對計數(shù)的方法用來檢測KRIBB11對At T20細(xì)胞活性及細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞計數(shù)用來檢測KRIBB11對At T20細(xì)胞周期的影響。Caspase-Glo 3/7試劑盒用來檢測KRIBB11對細(xì)胞凋亡的影響。Pomc-Luc和Nur RE-Luc報告基因檢測方法用來檢測KRIBB11對At T20細(xì)胞Pomc啟動子活性的影響。實時定量PCR用來確定KRIBB11對Pomc轉(zhuǎn)錄的影響。放射免疫法用來檢測At T20細(xì)胞、小鼠原代垂體細(xì)胞、人促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞上清ACTH的濃度。HSF1小干擾RNA用來確認(rèn)HSF1抑制劑對細(xì)胞活性及ACTH分泌的影響。結(jié)果熱休克刺激并不影響At T20細(xì)胞內(nèi)HSF1的表達(dá)。與對照組相比,KRIBB11刺激會引起HSF1特異性條帶下移。熱休克刺激可以極大提高HSE的啟動子活性,HSP90的N末端抑制劑17-AAG則在非熱休克和熱休克刺激條件下均提高HSE的啟動子活性。KRIBB11處理會降低非熱休克和熱休克刺激條件下基礎(chǔ)狀態(tài)HSE啟動子活性或17-AAG激活的HSE啟動子活性。KRIBB11刺激也可以濃度或時間依賴性地降低At T20細(xì)胞的細(xì)胞活性,IC50為10μM。通過臺盼藍(lán)染色細(xì)胞絕對計數(shù)的方法也確認(rèn)了KRIBB11對At T20細(xì)胞增殖的濃度依賴性抑制性作用。并且KRIBB11誘導(dǎo)At T20細(xì)胞G2/M期阻滯。KRIBB11也被發(fā)現(xiàn)在非細(xì)胞毒性濃度條件下并不影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程。KRIBB11可以降低基礎(chǔ)狀態(tài)或地塞米松刺激下的Pomc及Nur RE元件啟動子活性,此抑制效應(yīng)也通過RT-PCR及兩條不同序列的HSF1小干擾RNA沉默所確認(rèn)。此外,KRIBB11濃度依賴性地降低基礎(chǔ)狀態(tài)及小劑量地塞米松刺激下的At T20細(xì)胞上清ACTH的分泌,HSF1小干擾RNA沉默也可抑制細(xì)胞上清ACTH的分泌。而且,在4例原代培養(yǎng)的人ACTH腺瘤中,KRIBB11抑制了3例ACTH的分泌,但不與地塞米松產(chǎn)生疊加抑制效應(yīng)。然而KRIBB11并不影響小鼠正常垂體原代培養(yǎng)細(xì)胞的ACTH分泌。結(jié)論HSF1在基礎(chǔ)狀態(tài)下的At T20細(xì)胞系內(nèi)處于組成性活化狀態(tài),其活力可以被正負(fù)調(diào)節(jié)。在At T20細(xì)胞中,HSF1特異性抑制劑KRIBB11是通過抑制HSF1的活性來發(fā)揮其HSF1抑制作用。KRIBB11可以抑制At T20細(xì)胞活性及細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)G2/M期阻滯,但并不影響細(xì)胞凋亡。此外,KRIBB11及HSF1小干擾RNA均可在體外降低促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤細(xì)胞ACTH的分泌。HSF1可以作為庫欣病的潛在治療靶點。第三部分抑制HSF1調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體活性反式阻抑POMC的轉(zhuǎn)錄目的探討HSF1抑制對At T20細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體活性的調(diào)節(jié)作用方法MMTV-Luc報告基因法和實時定量PCR用來檢測GR激動劑地塞米松和HSF1抑制劑KRIBB11對At T20細(xì)胞內(nèi)GR轉(zhuǎn)錄活性及表達(dá)的影響。細(xì)胞總蛋白Western Blot用來檢測HSF1失活后GR、HSP70蛋白水平的變化。細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白的Western Blot用來檢測地塞米松和HSF1抑制劑KRIBB11對At T20細(xì)胞內(nèi)GR胞核轉(zhuǎn)運的影響。HSF1小干擾RNA用來確認(rèn)HSF1抑制劑對GR活性造成的影響。結(jié)果與空白組或單獨地塞米松組相比,HSF1抑制劑KRIBB11能提高At T20細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)或地塞米松誘導(dǎo)下的MMTV報告基因活性,基礎(chǔ)狀態(tài)下的最大效應(yīng)濃度為10μM,地塞米松誘導(dǎo)下KRIBB11 2.5μM也可提高3.2倍的MMTV報告基因活性。KRIBB11和地塞米松下調(diào)At T20細(xì)胞的GR轉(zhuǎn)錄水平,但延長藥物作用時間至24h則可逆轉(zhuǎn)此抑制效應(yīng)。KRIBB11處理下的At T20細(xì)胞內(nèi)Hsp70和Hsf1基因的轉(zhuǎn)錄下降。Western Blot顯示KRIBB11可以濃度依賴性的增加GR蛋白表達(dá),但對HSP70蛋白的表達(dá)無明顯影響。蛋白酶體抑制劑MG132作用下,KRIBB11可以抑制蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)的HSP70蛋白表達(dá)的增加,而蛋白翻譯抑制劑Cycloheximide作用下,KRIBB11并不影響HSP70蛋白的表達(dá)。此外檢測細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核組分,KRIBB11并不會增加地塞米松誘導(dǎo)的GR胞核轉(zhuǎn)運效應(yīng)。兩條不同的沉默序列產(chǎn)生的HSF1的暫時沉默也會增加MMTV報告基因的活性、降低GR的轉(zhuǎn)錄水平、增加GR的蛋白表達(dá)。結(jié)論HSF1抑制可以增加糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄活性及蛋白表達(dá),激活GR對其自身基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制,發(fā)揮其對POMC基因的反式阻抑效應(yīng)。
【圖文】：

正常垂體和ACTH腺瘤HSF1免疫組化染色（NP：正常垂體，，CUSH：ACTH

29圖 2：ACTH 腺瘤 HSF1 表達(dá)水平與患者性別、激素分泌水平及腫瘤直徑和侵襲性的相關(guān)性分析（AM cortisol：清晨 9 點皮質(zhì)醇，UFC：24h 尿游離皮質(zhì)醇）
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R736.4

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