【摘要】：胃癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率第四位,且具有很高的致死率。我國的胃癌死亡病例占全球胃癌死亡總數(shù)的40%。胃癌患者的預(yù)后不良,即使是經(jīng)根治性切除手術(shù)治療聯(lián)合化學(xué)治療的胃癌患者其五年生存率僅為35-40%。這一結(jié)果可能是由胃癌的異質(zhì)性和非個體臨床治療導(dǎo)致的。相較于傳統(tǒng)的腫瘤治療方法,腫瘤靶向治療將腫瘤的治療帶入一個嶄新的階段,研究探尋新的并且有效的腫瘤生物靶點成為近年來國際上腫瘤靶向治療的熱點之一。micro RNAs(mi RNAs)是一種長度在21-25nt的單鏈非編碼RNA,通過與靶基因3′非編碼區(qū)(untranslate dregions,UTR)的相互結(jié)合降解靶基因m RNA或是抑制靶基因m RNA的表達,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。mi RNAs能夠調(diào)節(jié)大約30%m RNAs,具有強大的生物學(xué)功能。近年來大量研究發(fā)現(xiàn),mi RNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用。因此,mi RNAs極有可能成為腫瘤靶向治療的靶點之一。mi R-200家族根據(jù)種子區(qū)域核苷酸序列不同分成mi R-200a,-200b,-200c,-141和-429五個成員,他們成簇表達,轉(zhuǎn)錄為兩個多順反子的原始mi RNA轉(zhuǎn)錄物mi R-200b-200a-429和mi R-200c-141,分別位于人第1(1p36.33)和12(12p13.31)常染色體上。mi R-200家族在多種腫瘤中的表達存在異常,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。但是已有研究結(jié)果表明,在不同的組織中mi R-200家族的表達、功能及其調(diào)控機制存在差異甚至相反。mi R-200家族至今未被作為重要的生物治療靶點在胃癌中進行深入研究,其家族成員在胃癌中的表達、功能和調(diào)節(jié)機制依然不是很清楚。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測mi R-200家族五個成員在胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中的表達,同時檢測胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27和胃上皮細胞株GES-1中mi R-200c和mi R-141的表達,深入分析mi R-200c和mi R-141的表達水平與胃癌患者臨床病理特征、無病生存期(disease-free survival,DFS)及腫瘤標(biāo)記物CA50、CEA、CA199和CA724的關(guān)系。單獨或同時進行mi R-200c和mi R-141的過表達或沉默,并通過CCK-8(Cell-Counting Kit-8 assay)實驗、劃痕實驗和Transwell實驗研究mi R-200c和mi R-141對胃癌細胞株SGC-7901增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響,利用雙熒光素酶報告基因分析檢測mi R-200c和mi R-141對其預(yù)測靶基因E盒結(jié)合鋅指蛋白-1、-2(zinc finger E-box-binding homeobox 1/2,ZEB1/2)的靶向作用,采用q RT-PCR和Western-blot檢測胃癌細胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141對其預(yù)測靶基因ZEB1/2及ZEB1/2的抑制基因E-cadherin的影響。同時檢測胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中mi R-200c和mi R-141預(yù)測靶基因ZEB1和ZEB2的表達情況,分析其與mi R-200c和mi R-141表達水平的關(guān)系。利用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換-甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Bisulfite conversion-specific and methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和q RT-PCR技術(shù)檢測胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中mi R-200c/141簇上游Cp G島的甲基化水平及TGF-β的表達情況,分析其與mi R-200c和mi R-141表達水平的關(guān)系。采用q RT-PCR技術(shù)檢測TGF-β和去甲基化抗腫瘤藥物地西他濱(5-aza-2′-deoxycytidine,5-Ad C)對mi R-200c和mi R-141在胃癌細胞株SGC-7901中表達的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:第一部分mi R-200家族在胃癌組織和細胞系中的表達及其與臨床病理特征和DFS的關(guān)系目的:通過檢測mi R-200家族在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達,以及在四種胃癌細胞系和一種正常胃上皮細胞系中的表達,探討其在胃癌中的表達情況及其與胃癌患者臨床病理特征及DFS的關(guān)系。方法:采用q RT-PCR技術(shù)檢測mi R-200家族在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達,檢測mi R-200c和mi R-141在四種胃癌細胞系和一種正常胃上皮細胞系中的表達情況�；仡櫺苑治銎浔磉_水平與胃癌患者的臨床病理特征及DFS的相關(guān)性。胃癌患者的臨床病理特征包括患者年齡、性別、組織學(xué)分級、腫瘤TNM分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移情況、脈管瘤栓情況。另外,分析了mi R-200c和mi R-141表達與胃癌患者腫瘤標(biāo)記物CA50、CEA、CA199和CA724表達水平的相關(guān)性。結(jié)果1 mi RNA-200家族在胃癌組織和配對的癌旁非癌組織中的表達水平。64例胃癌標(biāo)本中,mi R-200a,mi R-200b,mi R-200c,mi R-141和mi R-429的表達下調(diào)率分別是53.13%(34/64),48.44%(31/64),78.13%(50/64),76.19(48/63,1例數(shù)據(jù)丟失)和50.00%(32/64)。與配對癌旁非癌組織相比,mi R-200c和mi R-141在胃癌組織中的表達顯著降低(P0.001,P0.001),mi R-200a,mi R-200b和mi R-429的表達沒有顯著差異(P=0.258,P=0.501,P=0.870)。另外,mi R-200c和mi R-141的表達存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.840,P0.001)。2 mi R-200c和mi R-141在胃癌細胞系及正常胃上皮細胞系中的表達情況。與正常胃上皮細胞GES-1相比,mi R-200c在胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和HGC-27中的表達顯著降低(P=0.003,P=0.003,P=0.002,P=0.008);mi R-141在胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和HGC-27中的表達亦顯著降低(P=0.001,P=0.002,P=0.001,P0.001)。3胃癌組織中mi R-200c和mi R-141的表達與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。63例胃癌患者中,mi R-200c的表達水平與腫瘤TNM分期、腫瘤侵襲深度、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓情況存在顯著相關(guān)性(P=0.021,P=0.008,P=0.001,P=0.050),與患者性別、年齡、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況沒有顯著相關(guān)性(P=0.062,P=0.906,P=0.218,P=0.139)。采用多元線性回歸(multiple linear regression)的方法綜合分析腫瘤TNM分期、腫瘤侵襲深度、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓對mi R-200c表達的影響,發(fā)現(xiàn)腫瘤TNM分期、腫瘤侵潤深度與脈管瘤栓與mi R-200c的表達存在顯著負相關(guān)關(guān)系(Beta=-0.424,-0.219,-0.453;t=-2.687,-1.398,-3.003;P=0.004,0.009,0.001)。mi R-141的表達水平與腫瘤侵襲深度存在顯著相關(guān)性(P=0.004),與患者性別、年齡、組織學(xué)分級、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移情況、脈管瘤栓情況沒有顯著相關(guān)性(P=0.937,P=0.444,P=0.373,P=0.160,P=0.172,P=0.057,P=0.630)。另外,mi R-141的表達水平與外周血中CA-724的水平呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.258,P=0.047)。4胃癌組織中mi R-200c和mi R-141的表達與胃癌患者DFS的相關(guān)性。63例胃癌患者中,mi R-200c高表達組與低表達的中位DFS為22.0(月)和13.5(月),mi R-141高表達組與低表達的中位DFS為21.3(月)和13.5(月)。mi R-200c和mi R-141的表達水平與患者DFS呈負相關(guān)關(guān)系(P=0.002和P=0.012)。結(jié)論1 mi R-200c和mi R-141在胃癌組織中的表達顯著低于配對癌旁非癌組織,而其他mi R-200家族成員沒有顯著變化中。與正常胃上皮細胞GES-1相比,mi R-200c和mi R-141的表達在4株胃癌細胞株也顯著降低。提示mi R-200c和mi R-141可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。2胃癌組織中mi R-200c和mi R-141表達與腫瘤侵潤深度與脈管瘤栓情況存在顯著負相關(guān)關(guān)系,提示mi R-200c和mi R-141可能在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。3 mi R-200c和mi R-141可能成為胃癌預(yù)后的潛在提示指標(biāo)。第二部分mi R-200c和mi R-141對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響及其機制目的:探討mi R-200c和mi R-141在胃癌中的功能及其發(fā)揮功能的機制。方法:單獨或共同轉(zhuǎn)染mi R-200c和mi R-141模擬物或是抑制物或是陰性對照,通過CCK-8、細胞劃痕實驗和細胞侵襲實驗觀察mi R-200c和mi R-141在胃癌細胞SGC-7901增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用。運用Micro RNA生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件,對其可能的作用靶序列進行預(yù)測分析,結(jié)合mi R-200c和mi R-141在胃癌細胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能,進行進一步篩選。通過雙熒光素酶報告基因分析的方法檢測對其預(yù)測靶基因靶向作用,采用q RT-PCR和Western-blot檢測胃癌細胞株SGC-7901中mi R-200c/141簇對其預(yù)測靶基因的影響。同時檢測胃癌組織和其配對癌旁非癌組織中mi R-200c/141預(yù)測靶基因的表達情況,分析其與mi R-200c和mi R-141表達水平的關(guān)系。結(jié)果1 mi R-200c或(和)mi R-141對胃癌細胞株SGC-7901細胞增殖能力的影響。CCK-8細胞增殖實驗檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞48小時后,All Stars Negative Control si RNA轉(zhuǎn)染組(陰性對照組)、mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組、mi R-200c Inhibitor轉(zhuǎn)染組、mi R-141mimic轉(zhuǎn)染組、mi R-141Inhibitor轉(zhuǎn)染組、,mi R-200c/141 mimic轉(zhuǎn)染組和mi R-200c/141 Inhibitor轉(zhuǎn)染組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.859,0.057,0.103,0.100,0.094,0.072,0.141)。mi R-200c和mi R-141對人胃癌細胞株SGC-7901細胞的增殖沒有明顯影響。2 mi R-200c或(和)mi R-141對人胃癌細胞株SGC-7901細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。劃痕實驗結(jié)果顯示,劃痕24小時后,與空白對照組相比,mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組和mi R-141mimic轉(zhuǎn)染組劃痕愈合比例降低,但統(tǒng)計學(xué)沒有顯著差異(P=0.073,0.202)。mi R-200c Inhibitor轉(zhuǎn)染組和mi R-141 Inhibitor轉(zhuǎn)染組劃痕愈合比例增加,但統(tǒng)計學(xué)沒有顯著差異(P=0.130,0.066);mi R-200c/141 mimics共同轉(zhuǎn)染組24小時后劃痕愈合比例明顯降低(P0.001)。相應(yīng)的,mi R-200c/141 Inhibitor共同轉(zhuǎn)染組24小時后劃痕愈合比例明顯增加(P0.001)。Transwell實驗亦得出相符結(jié)果,與空白對照組相比,mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組和mi R-141mimic轉(zhuǎn)染組24小時后每個視野下穿過細胞數(shù)減少,但統(tǒng)計學(xué)沒有顯著差異(P=0.302,0.872);mi R-200c Inhibitor轉(zhuǎn)染組和mi R-141Inhibitor轉(zhuǎn)染組24小時后每個視野下穿過細胞數(shù)增大,但統(tǒng)計學(xué)沒有顯著差異(P=0.089,0.057);mi R-200c/141 mimics共同轉(zhuǎn)染組24小時后每個視野下穿過細胞數(shù)明顯減少(P0.001)。相應(yīng)的,mi R-200c/141Inhibitor共同轉(zhuǎn)染組24小時后每個視野下穿過細胞數(shù)明顯增加(P0.001)。mi R-200c和mi R-141抑制人胃癌細胞株SGC-7901細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。3雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證ZEB1和ZEB2為mi R-200c/-141的共同靶基因。雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示,共同轉(zhuǎn)移mi R-200c/141 mimics能夠顯著降低ZEB1和ZEB2的相對熒光強度(P0.001,P=0.001),而單獨轉(zhuǎn)染mi R-200c或是mi R-141 mimics能夠降低ZEB1和ZEB2的相對熒光強度,但統(tǒng)計學(xué)沒有顯著性差異。4在胃癌細胞株SGC-7901中過表達mi R-200c/141對ZEB1/2和E-cadherin表達的影響。mi R-200c/141 mimics共同轉(zhuǎn)染胃癌細胞SGC-7901后,ZEB1和ZEB2m RNA和蛋白的表達水平顯著降低,E-cadherin表達水平顯著升高。相應(yīng)地,共同轉(zhuǎn)染mi R-200c/141抑制物后,ZEB1和ZEB2 m RNA和蛋白的表達水平顯著升高,E-cadherin表達水平顯著降低。5 ZEB1/2在胃癌中的表達情況及其與mi R-200c/141的關(guān)系。64例胃癌標(biāo)本中,ZEB1和ZEB2的表達上調(diào)率都是68.75%(44/64)。相較于配對癌旁非癌組織,ZEB1和ZEB2在胃癌組織中的表達顯著升高(P=0.001;P=0.004)。ZEB1的表達水平與mi R-200c表達水平顯著負相關(guān)(r=-0.273,P=0.029),ZEB2的表達水平與mi R-200c和mi R-141的表達水平顯著負相關(guān)(r=-0.426,-0.494;P=0.001,0.001)。結(jié)論1 mi R-200c/141可抑制胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。2在胃癌細胞株SGC-7901中,mi R-200c/141通過靶向抑制ZEB1和ZEB2的表達,進而誘導(dǎo)E-cadherin的表達升高來發(fā)揮其抑制細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。3在胃癌患者中mi R-200c/141可能是通過ZEB1和(或)ZEB2途徑調(diào)控胃癌的發(fā)展。第三部分TGF-β和mi R-200c/141 Cp G島甲基化水平對mi R-200c/141目的:通過檢測胃癌組織和配對癌旁非癌組織中TGF-β的表達水平和mi R-200c/141 Cp G島甲基化水平,探討其與mi R-200c和mi R-141表達水平的相關(guān)性。方法:采用q RT-PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上檢測TGF-β在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達;運用MSP方法檢測胃癌組織和配對癌旁非癌組織中mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平。分析TGF-β表達水平及mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平與mi R-200c和mi R-141水平的相關(guān)性。地西他濱和(或)TGF-β處理胃癌細胞株SGC-7901,觀察其對mi R-200c和mi R-141表達的影響。結(jié)果1 TGF-β在胃癌中的表達情況及其與mi R-200c/141的相關(guān)性。63例胃癌標(biāo)本中,TGF-β的表達上調(diào)率都是66.67%(42/63)。與配對癌旁非癌組織相比,TGF-β在胃癌組織中的表達顯著升高(Median:0.84,2.50,Interquartile Range:0.42,2.43,P=0.005)。TGF-β的表達水平與mi R-200c和mi R-141的表達水平呈顯著負相關(guān)關(guān)系(r=-0.364,-0.526;P=0.003,0.001)。2胃癌中mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平及其與mi R-200c/141的相關(guān)性。63例胃癌標(biāo)本中,mi R-200c/141 Cp G島的甲基化升高率為84.13%(53/63)。與配對癌旁非癌組織相比,mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平在胃癌組織中顯著升高(Median:0.39,0.68,Interquartile Range:0.16,0.30,P0.001)。mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平與mi R-200c和mi R-141的水平呈顯著負相關(guān)關(guān)系(r=-0.303,-0.522;P=0.016,0.001)。3 TGF-β與地西他濱對SGC-7901細胞中mi R-200c和mi R-141表達的影響。TGF-β誘導(dǎo)胃癌細胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141表達顯著降低(P=0.006;P=0.005)。地西他濱誘導(dǎo)胃癌細胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141表達顯著升高(P=0.013;P=0.027),并能夠緩解由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的mi R-200c和mi R-141表達的降低(P=0.005;P=0.007)。結(jié)論1胃癌中TGF-β的表達水平和mi R-200c/141Cp G島的甲基化水平明顯升高。2 TGF-β誘導(dǎo)胃癌中mi R-200c和mi R-141表達降低。3胃癌中升高的mi R-200c/141Cp G島的甲基化水平誘導(dǎo)mi R-200c和mi R-141表達降低。4地西他濱能夠通過降低mi R-200c/141Cp G島的甲基化水平促進mi R-200c和mi R-141的表達,并能夠緩解TGF-β對mi R-200c和mi R-141的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：2546856