【摘要】：肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快,對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高,男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位,女性發(fā)病率占第二位,死亡率占第二位,造成患者死亡的主要原因是肺癌很早就發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移。因此,有效地控制肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移已成為當前肺癌研究和治療的重要課題和難題。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一類長約22nt的非編碼內(nèi)源性小RNA,可以與基因m RNA的3’UTR區(qū)結合,起到在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的作用。通過與靶m RNA的互補配對在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,導致m RNA的降解或翻譯抑制,控制哺乳類動物約30%的蛋白質(zhì)編碼基因活性。mi RNA與其靶m RNA分子組成了一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡,參與包括細胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育等多種生物學過程。研究顯示,在多種腫瘤中mi RNA表達異常,可能與腫瘤的形成、細胞分化及凋亡有關,它們有的起癌基因作用,有的則起抑癌基因作用。已有研究發(fā)現(xiàn)多種mi RNA可通過不同的途徑調(diào)控肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移,如mi R-126、mi R-183和let-7可分別通過作用于其各自的靶基因調(diào)控肺癌細胞的增殖和遷移能力。因此,深入研究不同mi RNAs家族成員對肺癌的作用對于闡明mi RNAs在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的機制具有重要意義。在前期研究工作中,我們應用mi RNA表達譜芯片檢測了具有高低不同轉(zhuǎn)移潛能的肺癌細胞株95D和95C細胞,芯片結果顯示mi R-517a-3p在95D中高表達,mi R-610在95C中高表達。因此,在本研究中,我們將應用實時定量PCR方法,驗證mi R-517a-3p和mi R-610在95D和95C細胞中的表達水平,并進一步探討mi R-517a-3p和mi R-610對肺癌細胞增殖和侵襲的作用及其可能機制,為后續(xù)基于mi RNAs的肺癌臨床生物治療的新靶點開發(fā)提供實驗依據(jù)。本研究目的、方法、結果及結論如下:目的:Micro RNAs(mi RNAs)是一種非編碼的小分子RNA,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,mi RNAs對肺癌的作用及機制仍需進一步闡明。本研究探討了mi R-517a-3p和mi R-610對肺癌細胞增殖和侵襲能力的作用及機制。方法:1、人肺癌細胞株95D和95C用含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),將實驗細胞分別分為mi R-517a-3p和mi R-610類似物轉(zhuǎn)染組、抑制物轉(zhuǎn)染組、類似物陰性對照轉(zhuǎn)染組、抑制物陰性對照轉(zhuǎn)染組、只加轉(zhuǎn)染試劑的空白對照組;2、應用實時定量PCR法檢測mi R-517a-3p和mi R-610在高低不同轉(zhuǎn)移能力肺癌細胞95D、95C中的表達水平;3、脂質(zhì)體2000介導分別轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p和mi R-610類似物和抑制物入95C和95D細胞,應用體外劃痕實驗檢測mi R-517a-3p和mi R-610對于肺癌細胞侵襲的作用;4、Transwell實驗檢測mi R-517a-3p和mi R-610對于肺癌細胞侵襲的作用,實驗分為基質(zhì)膠鋪板、細胞懸液制備、細胞接種、結果統(tǒng)計等步驟;5、應用CCK8實驗法,向細胞懸液中加入CCK8,培養(yǎng)2h后測定450nm吸光度,檢測mi R-517a-3p和mi R-610對于肺癌細胞生長的作用;6、應用Brd U摻入實驗法,將Brd U作用于細胞,后經(jīng)DNA變性、封閉、Bru D單抗及二抗孵育,檢測mi R-517a-3p和mi R-610對于肺癌細胞生長的作用;7、生物信息學軟件預測mi R-517a-3p和mi R-610潛在的靶基因,雙熒光素酶報告基因驗證mi R-517a-3p是否作用于FOXJ3 m RNA的3’UTR區(qū)預測靶位,同樣方法驗證mi R-610是否作用于GJA3 m RNA的3’UTR區(qū)預測靶位;8、Western blot法檢測FOXJ3和GJA3蛋白分別在95C和95D細胞中的表達水平。結果:(一)mi R-517a-3p對肺癌細胞增殖和侵襲能力的影響1、實時定量PCR結果顯示,mi R-517a-3p在95D細胞中的表達水平顯著高于其在95C細胞中表達,是95C細胞中表達水平的7.49±0.17倍,該實驗結果提示mi R-517a-3p在肺癌細胞中的高表達可能與肺癌細胞的高轉(zhuǎn)移能力相關;2、體外劃痕實驗結果顯示,95C細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p類似物后劃痕寬度顯著減小,劃痕愈合程度更高;95D細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p抑制物后劃痕寬度顯著增大,劃痕愈合程度降低。該實驗結果表明,mi R-517a-3p可以促進肺癌細胞的遷移能力;3、Transwell實驗結果顯示,與對照組相比,95C細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p類似物侵襲能力顯著提高,95D細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p抑制物侵襲能力顯著降低。該實驗結果表明,mi R-517a-3p可以促進肺癌細胞的侵襲能力;4、CCK-8實驗結果顯示,細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p類似物后增殖能力變強,轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p抑制物后增殖能力減弱,其他三組增殖能力差異無顯著差異。同時,細胞增殖能力改變在轉(zhuǎn)染后3d-4d時表現(xiàn)最為明顯。該實驗結果表明,mi R-517a-3p可以促進肺癌細胞的增殖;5、Brd U滲入實驗結果顯示,95C細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p類似物后增殖能力顯著增強,95D細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p抑制物后增殖能力顯著減弱。同時,細胞增殖能力改變在轉(zhuǎn)染后3d-4d時表現(xiàn)最為明顯。該實驗結果表明,mi R-517a-3p可以促進肺癌細胞的增殖;6、應用在線生物信息學預測軟件mi Randa預測FOXJ3可能為mi R-517a-3p的靶基因。對mi R-517a-3p和FOXJ3的野生型結合位點進行定點突變,mi R-517a-3p類似物陰性對照和mi R-517a-3p類似物野生型FOXJ3共轉(zhuǎn)染組的95C細胞熒光素酶活性顯著下降,而突變型轉(zhuǎn)染組中熒光素酶活性無顯著變化。該實驗結果表明,mi R-517a-3p可以直接調(diào)控FOXJ3基因;7、應用Western印跡方法檢測FOXJ3蛋白表達水平變化,結果顯示,與對照組相比,95C細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p類似物后,FOXJ3蛋白表達水平顯著降低,95D細胞轉(zhuǎn)染mi R-517a-3p抑制物后,FOXJ3蛋白表達水平顯著提高。該實驗結果表明,mi R-517a-3p可能抑制FOXJ3蛋白的表達。(二)mi R-610對肺癌細胞增殖和侵襲能力的影響1、實時定量PCR結果顯示,mi R-610在95C細胞中的表達水平顯著高于其在95D細胞中表達,是95D細胞中表達水平的8.75±0.21倍,該實驗結果提示mi R-610在肺癌細胞中的低表達可能與肺癌細胞的高轉(zhuǎn)移能力相關;2、體外劃痕實驗結果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-610抑制物組95C細胞劃痕的寬度明顯低于空白對照組和轉(zhuǎn)染mi R-610抑制物對照組,劃痕愈合程度更高。轉(zhuǎn)染mi R-610類似物組95D細胞劃痕的寬度明顯高于空白對照組和轉(zhuǎn)染mi R-610類似物對照組,劃痕愈合程度降低。該實驗結果表明,mi R-610可以抑制肺癌細胞的遷移能力;3、Transwell實驗結果顯示,與對照組相比,95C細胞轉(zhuǎn)染mi R-610抑制物侵襲能力顯著提高,95D細胞轉(zhuǎn)染mi R-610類似物侵襲能力顯著降低。該實驗結果表明,mi R-610可以抑制肺癌細胞的侵襲能力;4、CCK-8實驗結果顯示,95C細胞轉(zhuǎn)染mi R-610抑制物后增殖能力顯高于空白對照組95C細胞,95D細胞轉(zhuǎn)染mi R-610類似物后增殖能力明顯低于空白對照組95D細胞。而轉(zhuǎn)染mi R-610抑制物對照和mi R-610類似物對照組細胞的增殖能力較空白對照組細胞無明顯改變。該實驗結果表明,mi R-610可抑制肺癌細胞的增殖;5、Brd U滲入實驗結果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-610抑制物后95C細胞的增殖能力明顯增強,空白對照組和轉(zhuǎn)染mi R-610類似物組95D細胞的增殖細胞數(shù)分別為(68.75±4.28)%和(46.13±3.27)%,轉(zhuǎn)染mi R-610類似物后95D細胞增殖能力明顯降低。該實驗結果表明,mi R-610可以抑制肺癌細胞的增殖;6、應用在線生物信息學預測軟件mi Randa預測GJA3可能為mi R-610的靶基因。對mi R-610和GJA3的野生型結合位點進行定點突變,mi R-610類似物和野生型GJA3共轉(zhuǎn)染組的95D細胞熒光素酶活性明顯下降,而突變型轉(zhuǎn)染組中熒光素酶活性無明顯變化。該實驗結果表明,mi R-610可以直接調(diào)控GJA3基因的表達;7、應用Western印跡方法檢測GJA3蛋白表達水平變化,結果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-610抑制物后,95C細胞中GJA3蛋白的表達水平明顯提高,為空白對照組95C細胞的3.49倍。轉(zhuǎn)染mi R-610類似物后,95D細胞中GJA3蛋白的表達水平明顯降低,空白對照組95D細胞中GJA3蛋白的表達量為轉(zhuǎn)染mi R-610類似物組的6.82倍。該實驗結果表明,mi R-610可能抑制GJA3蛋白的表達。結論:mi R-517a-3p靶向FOXJ3基因促進人肺癌細胞的侵襲和增殖作用,mi R-610靶向GJA3基因抑制人肺癌細胞的侵襲和增殖作用。
【圖文】：

Real time PCR 檢測 95C 和 95D 細胞中 miR-517a-3p 的表注：圖中 95C 細胞為基準，表達水平為 1.00，p<0.0117a-3p 對肺癌 95C 和 95D 細胞遷移能力的影響痕遷移實驗是檢測細胞遷移能力的一種方法，在 9

95C 細胞轉(zhuǎn)染 miR-517a-3p 類似物后劃痕寬度顯著減�。╬<0.01，圖3.2），劃痕愈合程度更高；95D 細胞轉(zhuǎn)染 miR-517a-3p 抑制物后劃痕寬度顯著增大（p<0.01，圖 3.3），劃痕愈合程度降低。該實驗結果表明，，miR-517a-3p 可以促進肺癌細胞的遷移能力。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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7 ;美證實SLC蛋白能殺死肺癌細胞[N];中國中醫(yī)藥報;2000年

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本文編號：2542307